文章分享：利用對Binder的結(jié)合界面增加組氨酸來讓其具有pH的敏感性

文章來源公眾號：生物快評           作者：sw

David Baker，2024諾貝爾化學獎的主，華盛頓大學教授

2025年9月29日David Baker，2024諾貝爾化學獎得主發(fā)表了一篇《Computational design of pH-sensitive binders》，這篇文章利用對Binder的結(jié)合界面增加組氨酸來讓其具有pH的敏感性。

背后生化化學原理

氨基酸的結(jié)構(gòu)上，一端為氨基NH2，一端為COOH基團，中間為一個CH，其中CH上為側(cè)鏈基團，R基團的差異就會導致氨基酸性質(zhì)的改變。那么根據(jù)R基團的差異，可以將氨基酸分成4類：非極性氨基酸（就是不電離，不親水的氨基酸）；極性氨基酸（就是不帶電，但是親水的氨基酸）；堿性氨基酸（即在中性pH下帶正電的氨基酸）；酸性氨基酸（即在中性pH下帶負電的氨基酸）。

20種氨基酸分類表（4大類）

氨基酸的電解和電離常數(shù)pKa
因為氨基酸同時具有酸性基團COOH和堿性基團NH2，且有些R基團會額外電離，所以每個氨基酸的每個基團都有自己的電離常數(shù)，pKa。pKa 是衡量一個酸強弱的定量指標。

Ka 是這個解離反應(yīng)的平衡常數(shù)，其表達式為：

其中，[ ] 表示濃度。pKa值越小，酸性越強；pKa值越大，酸性越弱。

pKa 是Ka 的負常用對數(shù)：

氨基酸的電解，比如每個氨基酸都有電解常數(shù)1pKa1（COOH電解釋放H+的能力），NH2基團的電解常數(shù)pKa2(即NH2釋放H+的能力)。其中有7個氨基酸的R基團也能夠電離，所以他們額外有了pK_R（即R基團電離釋放H+的能力）。

這7個氨基酸即3個堿性氨基酸Lysine\Argine\Histidine，2個酸性氨基酸aspartic acid和glutamic acid。

以及1個親水性的Cysteine，因為其側(cè)鏈含有巰基（R-SH），該基團在堿性環(huán)境中可作為質(zhì)子供體，失去質(zhì)子后形成硫醇陰離子（R-S⁻）；一個疏水性的Tyrosine（酪氨酸的酚羥基可發(fā)生去質(zhì)子化，該化學特性與苯酚（由苯環(huán)和氧原子構(gòu)成）類似，固有pKr）。

氨基酸的等電點
如剛才介紹的氨基酸的電離常數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)氨基端和羧基端和部分的R基團都對氨基酸的整體電離有貢獻作用，此外氨基酸所處在的環(huán)境pH也會影響氨基酸的電離。溶液環(huán)境的pH值決定了這些基團的解離狀態(tài)：

在低pH（酸性）環(huán)境中，溶液中的H⁺濃度高，會抑制羧基的解離，并促使氨基結(jié)合H⁺。因此，氨基酸整體帶正電荷。

在高pH（堿性）環(huán)境中，溶液中的OH⁻會中和H⁺，促使羧基解離釋放H⁺，同時氨基也難以結(jié)合H⁺。因此，氨基酸整體帶負電荷。

隨著pH值從低到高變化，氨基酸的凈電荷會從正電荷逐漸變?yōu)樨撾姾�。在這個變化過程中，必然存在一個特定的pH值，使得氨基酸的正負電荷數(shù)恰好相等，凈電荷為零。這個pH值就是該氨基酸的等電點（pI）。

如下圖給出了20個氨基酸的pKa和pI值。

pH和一些細胞內(nèi)吞過程有關(guān)系，比如新生兒Fc受體，FcRn

Biopolymers. 2017 Dec 21. doi: 10.1002/bip.23095.

新生兒Fc受體，是一種在整個生命體內(nèi)都發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)。它最初是在新生兒腸道中被發(fā)現(xiàn)的，負責吸收母體乳汁中的抗體（IgG），因此得名。FcRn的核心功能是延長抗體（IgG）和白蛋白在體內(nèi)的壽命。其工作機制非常獨特，依賴于pH值的差異：

血液中的抗體（IgG）和白蛋白會被細胞通過“胞飲”作用隨機地吞進細胞內(nèi)，形成名為“內(nèi)體”的小泡。內(nèi)體內(nèi)的環(huán)境是酸性的（pH約6.0-6.5）。酸性環(huán)境下結(jié)合：在酸性條件下，F(xiàn)cRn受體的結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，使其能夠與IgG或白蛋白的Fc段（恒定區(qū)）高親和力地結(jié)合。可以理解為，在酸性“房間”里，F(xiàn)cRn能“認出”并“抓住”這些有用的分子。循環(huán)與釋放：沒有被FcRn結(jié)合的其它蛋白質(zhì)會被運送到溶酶體中進行降解。而被FcRn“抓住”的IgG和白蛋白則會被安全地運輸回細胞表面。中性環(huán)境下釋放：當這個載有FcRn和其“貨物”的小泡回到細胞表面時，會遇到血液中性的環(huán)境（pH約7.4）。在這個條件下，F(xiàn)cRn與IgG/白蛋白的親和力急劇下降，于是釋放它們回血液中。過程重復：這個循環(huán)過程周而復始，使得IgG和白蛋白在體內(nèi)的半衰期（存活時間）非常長（IgG的半衰期約為21天）。

實驗設(shè)計目標

蛋白設(shè)計的目標，在蛋白質(zhì)靶向降解的情況下，比如溶酶體靶向降解（Lysosome targeting chimeras (LYTACs)，需要一個binder，一端結(jié)合目標待降解分子，另一端靶向溶酶體循環(huán)受體（lysosome trafficking receptor (LTR)），這樣binder同時靶向LTR和目標分子后，則會通過LTR內(nèi)吞進入溶酶體將目標分子降解。傳統(tǒng)的這類LYTAC技術(shù)沒有考慮在lysosome中與目標分子的解離，導致了這類LYTAC binder分子在lysosome中也一同和目標分子一起水解，這樣導致了LYTAC binder的使用量需要增加。

所以作者就想能不能設(shè)計一個LYTAC binder，和目標分子在中性pH下結(jié)合能力強，在酸性pH環(huán)境下結(jié)合能力下降而與目標分子解離。

那么怎么做到呢？

需要增加一些在pH酸性環(huán)境下，Binder的結(jié)合能力下降或者Binder自身的結(jié)構(gòu)改變了。組氨酸是唯一側(cè)鏈pKa值接近中性pH（~7.64）的氨基酸殘基，這使得它對生物體內(nèi)的pH梯度變化尤為敏感。循環(huán)系統(tǒng)中的pH值約為7.4，內(nèi)吞體中為5.0-6.0，而腫瘤微環(huán)境（TME）中為6.0-6.5。根據(jù)其質(zhì)子化狀態(tài)的不同，組氨酸既能接受也能提供與帶電殘基之間的氫鍵。當環(huán)境pH低于其pKa值（約6.5）時，質(zhì)子化的組氨酸可作為兩個氫鍵的供體而非受體；而當環(huán)境pH高于pKa值時，去質(zhì)子化的組氨酸既能作為一個氫鍵的供體，又能作為另一個氫鍵的受體——這第二個氫鍵在轉(zhuǎn)移至pH6的酸性環(huán)境時會被破壞。

作者首先整體隨機增加binder的His的比例，發(fā)現(xiàn)并沒有效果。隨后作者按照兩種思路進行實驗：思路1是在binder與目標分子結(jié)合的表面增加His，比如His在pH中性環(huán)境不影響binder結(jié)合目標分子，而pH酸性條件下，His攜帶H+而影響了對目標分子的結(jié)合，從而達到解離的效果（即interface destablization）。另一個思路就是在binder的內(nèi)部增加His，在酸性pH環(huán)境下binder中His攜帶同電荷的H+而排斥作用從而達到了與目標分子的解離作用，這個思路的局限是需要這樣的binder分子較大，否則His會提前暴露。

比如靶向EpA2的binder，經(jīng)過interface destablization后，在pH=7.4下KD為678pM, 而在pH=5.4下，KD為15nM。所以EphA2 binder在酸性環(huán)境下親和力下降~20倍。

效果上，顯示pH-LYTAC在相同的劑量下可以靶向降解目標分子EphA2的能力顯著增強（~90%降解），而常規(guī)LYTAC技術(shù)降解目標分子效率只有~50%，原因在與pH-LYTAC可以循環(huán)利用。

這篇文章的核心生化原理并不復雜，難度是在于將His“裝飾”在binder的結(jié)合表面等，怎么保持不改變binder對目標分子在pH=7.4下的結(jié)合能力。因為我們知道這種binder的“結(jié)合表面”改動一個氨基酸都有可能改變binder的結(jié)合能力，甚至無法結(jié)合或者產(chǎn)生脫靶向能力。David baker實驗室首先通過計算等辦法找到結(jié)合的表面或者binder的核心，然后通過噬菌體展示技術(shù)進行篩選確定有效的binder。

作者David Baker為2024年諾獎得主，其實其導師，和導師的導師均獲得了諾獎。見下：

David Baker于2024年因開發(fā)蛋白質(zhì)折疊RossetaFold榮獲諾貝爾化學獎。

Randy Wayne Schekman是David baker的博士生導師，博士期間研究DNA聚合酶，個人獨立研究為囊泡運輸，2013年謝克曼與詹姆斯·羅思曼和托馬斯·聚德霍夫因為在細胞膜囊泡運輸方面有開創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)而共同獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。

Randy Wayne Schekman的博士生導師是Arthur Kornberg(1918年3月3日—2007年10月26日），他研究研究DNA聚合酶而于1959年的諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。