頂刊綜述解讀：RNA修飾系統(tǒng)作為疾病治療靶點(diǎn)的研究進(jìn)展
近日，芝加哥大學(xué)華人科學(xué)家何川教授團(tuán)隊(duì)在國際頂刊《Nature Reviews Drug Discovery》(IF=101.8) 發(fā)表題為 “RNA modification systems as therapeutic targets” 的綜述文章，全景式闡述了 RNA 修飾系統(tǒng)作為治療靶點(diǎn)的前沿進(jìn)展。文章系統(tǒng)梳理了 RNA 修飾調(diào)控蛋白的細(xì)胞功能與疾病關(guān)聯(lián)，重點(diǎn)聚焦 N6 - 甲基腺苷（m6A）通路，詳解了靶向 YTH reader 蛋白等抑制劑的開發(fā)突破，并展望了其他 RNA 修飾通路的靶標(biāo)潛力。這一綜述不僅為癌癥治療開辟了靶向表觀遺傳調(diào)控的全新路徑，更推動免疫治療實(shí)現(xiàn)策略升級，同時為干細(xì)胞治療與再生醫(yī)學(xué)提供了創(chuàng)新性思路，標(biāo)志著 RNA 修飾靶向療法已進(jìn)入臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵階段。
DOI:10.1038/s41573-025-01280-8
RNA修飾、調(diào)控蛋白及分子功能
在眾多RNA修飾中，N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)、N7-甲基鳥苷(N7-methylguanosine, m7G)、5-甲基胞苷(5-methylcytosine, m5C) 、N1-甲基腺苷(N1-methyladenosine, m1A)、假尿苷(Ψ)和2'-O-甲基化(2'-O-methylation, Nm)是調(diào)控基因表達(dá)和細(xì)胞生物學(xué)過程的關(guān)鍵化學(xué)標(biāo)記。與表觀基因組修飾類似，RNA修飾在不改變DNA或RNA序列的情況下對基因表達(dá)存在關(guān)鍵作用。
RNA修飾可以在共轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后添加，導(dǎo)致RNA結(jié)構(gòu)、加工、翻譯及降解的改變(表1)。這些功能由識別并結(jié)合修飾的RNA結(jié)合蛋白(RBPs，"readers")介導(dǎo)。除了RNA代謝和翻譯，RNA修飾還可以調(diào)控RNA:DNA雜合體形成，參與影響全局染色質(zhì)狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄。
此外，基于RNA修飾作用的多種關(guān)鍵生物通路與疾病的關(guān)聯(lián)正在逐步解析，如RNA修飾調(diào)控癌癥中的致癌通路，STM2457是第一個設(shè)計(jì)用于抑制RNA修飾酶催化活性的小分子，它能抑制m6A writer酶METTL3，在抑制急性髓性白血病(AML)小鼠模型中植入和擴(kuò)增，成功證明了靶向RNA修飾酶治療癌癥的潛力。這項(xiàng)研究開發(fā)的首個影響RNA修飾酶的候選藥物已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。令人意外的，一些已獲批的藥物也被發(fā)現(xiàn)是RNA修飾的有效調(diào)控劑，如帕金森病藥物安托卡朋(antecapone)被發(fā)現(xiàn)能抑制m6A去甲基酶FTO。綜上，這些進(jìn)展突顯了靶向RNA修飾治療疾病的潛力。
表1：RNA修飾、調(diào)控蛋白及分子功能
N6-甲基腺苷（m6A））
m6A是哺乳動物中最豐富的RNA修飾。平均每個哺乳動物轉(zhuǎn)錄本有三個m6A修飾，位于RRm6ACH(R=A/G;H=A/C/U)的共有序列中。m6A甲基化盡管發(fā)生在mRNA的各個區(qū)域，但在3'非翻譯區(qū)(UTR)和靠近終止密碼子處富集。m6A甲基化由"甲基轉(zhuǎn)移酶(writers)"METTL3和METTL14沉積，可被"去甲基化酶(erasers)"FTO和ALKBH5去除。m6A修飾的RNA通過與RNA結(jié)合蛋白來調(diào)控RNA代謝，包括加工、運(yùn)輸、翻譯及穩(wěn)定性（圖1），這些調(diào)控功能已在多種生物系統(tǒng)中得到了廣泛研究，m6A調(diào)控多種過程，如干細(xì)胞分化、組織發(fā)育、信號通路、應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)功能、病毒感染和代謝等，m6A失調(diào)與癌癥、免疫穩(wěn)態(tài)、代謝疾病和神經(jīng)紊亂相關(guān)。
METTL3、METTL14和調(diào)控亞基WTAP是沉積m6A的主要RNA甲基轉(zhuǎn)移酶"writers"復(fù)合體的關(guān)鍵組分，其中METTL3和METTL14形成核心穩(wěn)定的異源二聚體。METTL3表現(xiàn)出催化活性并結(jié)合甲基供體S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，而METTL14穩(wěn)定甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物以促進(jìn)RNA結(jié)合和甲基化。
m6A mRNA甲基化可通過影響RNA翻譯和穩(wěn)定性影響許多致癌通路(圖2)。例如，約1.5%的子宮內(nèi)膜癌患者在METTL14中有R298P突變殘基，與鄰近正常組織相比，大部分子宮內(nèi)膜癌中METTL3下調(diào)，導(dǎo)致m6A甲基化水平低。由此導(dǎo)致的PHLPP2 mRNA低甲基化降低了這種AKT激酶負(fù)調(diào)控因子的翻譯，而對mTORC2組分編碼mRNA的低甲基化抑制了mRNA衰變并增加mTORC2表達(dá)。結(jié)果，AKT通路被激活，刺激子宮內(nèi)膜癌的增殖和腫瘤發(fā)生。METTL14的純合R298P突變將其基序偏好從[G/A][G/A]ACU轉(zhuǎn)變?yōu)镚l[A][C/U]U。雖然METTL14變化確實(shí)導(dǎo)致mRNA整體甲基化減少，但在非經(jīng)典位點(diǎn)觀察到m6A甲基化增加。
p53通路也受m6A調(diào)控(圖2b)。METTL3-METTL14復(fù)合體甲基化編碼p53抑制因子MDM2的mRNA。METTL3和METTL14在AML中表達(dá)均升高。與健康個體相比，AML患者中MDM2 mRNA高度甲基化，增加了MDM2蛋白表達(dá)并抑制p53信號。METTL3還與MDM2競爭p53結(jié)合，從而穩(wěn)定p53。p53與METTL3互作促進(jìn)METTL3介導(dǎo)的m6A甲基化，進(jìn)而形成正反饋回路。
此外，調(diào)控m6A修飾或許能成為抗感染、調(diào)控免疫反應(yīng)以及增強(qiáng)免疫治療效果的新策略（圖3）。
圖4：靶向RNA修飾“writer”、“eraser”和“reader”蛋白的抑制劑。
FTO(肥胖相關(guān)基因，fat-mass and obesity-associated gene)和ALKBH5(AlkB同源蛋白5)是m6A去甲基化酶，能去除mRNA上的m6A修飾。FTO在多種癌癥中過表達(dá)，包括AML、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和乳腺癌，與不良預(yù)后相關(guān)。FTO通過去甲基化致癌轉(zhuǎn)錄本如MYC、BCL2和CEBPA促進(jìn)腫瘤發(fā)生。ALKBH5在缺氧條件下被誘導(dǎo)，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞、AML和乳腺癌中高表達(dá)，通過調(diào)控NANOG等干細(xì)胞因子維持癌癥干細(xì)胞特性。
ALKBH5也參與免疫細(xì)胞代謝。DEAD-box(DDX)解旋酶招募ALKBH5去甲基化m6A標(biāo)記的抗病毒轉(zhuǎn)錄本，抑制病毒感染后I型干擾素的產(chǎn)生。雙鏈DNA或人巨細(xì)胞病毒觸發(fā)的I型干擾素產(chǎn)生也受ALKBH5調(diào)控。此外，ALKBH5可以通過m6A去甲基化上調(diào)α-酮戊二酸脫氫酶(OGDH)mRNA，促進(jìn)先天免疫反應(yīng)非依賴性病毒復(fù)制。ALKBH5在T細(xì)胞激活時上調(diào)，并能調(diào)控CD4+ T細(xì)胞在自身免疫中的致病性。此外，ALKBH5在塑造腫瘤微環(huán)境(TME)中起關(guān)鍵作用，主要抑制抗癌免疫。
基于FTO在癌癥中的機(jī)制研究和可用的晶體結(jié)構(gòu)，已開發(fā)出多種小分子抑制劑(圖4c)。例如，2012年通過基于結(jié)構(gòu)的高通量篩選，發(fā)現(xiàn)了天然產(chǎn)物大黃素（rhein）作為FTO抑制劑，其在體外與FTO活性位點(diǎn)競爭性結(jié)合，Kd為2.4 μM。大黃素在白血病細(xì)胞中的IC50為21 μM，其對TKI耐藥細(xì)胞的應(yīng)用可恢復(fù)對TKI的敏感性。MO-I-500是另一種FTO抑制劑，其通過模擬維生素C的結(jié)構(gòu)來誘導(dǎo)一大類Fe(II)-依賴和2-氧戊二酸（2OG）-依賴雙加氧酶的活性。MO-I-500在體外對純化的FTO的IC50為8.7 μM，并在三陰性乳腺癌細(xì)胞中抑制其增殖。盡管大黃素和MO-I-500缺乏對FTO的選擇性，但2OG類似物compound 12顯示出對FTO約30倍的選擇性，其在HeLa細(xì)胞中的應(yīng)用導(dǎo)致mRNA m6A劑量依賴性增加。另一種天然致癌代謝產(chǎn)物R-2HG也顯示出對FTO的廣泛抗腫瘤效果。
通過基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)了ALKBH5抑制劑。例如，通過基于晶體結(jié)構(gòu)的虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)了化合物3和化合物6，它們在體外對ALKBH5的抑制作用分別為IC50=0.84 μM和1.79 μM。最近，通過高通量熒光偏振測定法揭示了一類新的ALKBH5抑制劑，具有1-芳基-1H-吡唑骨架，其中化合物20m顯示出對ALKBH5超過1000倍的選擇性，IC50為0.021 μM。
YTH結(jié)構(gòu)域蛋白作為m6A reader蛋白及其抑制劑
m6A調(diào)控在很大程度上依賴于其結(jié)合蛋白。研究最深入的reader蛋白YTS521-B同源(YTH)結(jié)構(gòu)域的家族蛋白YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1和YTHDC2。這些蛋白通過識別和結(jié)合m6A修飾的RNA來調(diào)控m6A修飾RNA命運(yùn)。YTHDF1促進(jìn)其m6A靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本翻譯，YTHDF1在多種患者腫瘤中表達(dá)升高，并與不良預(yù)后相關(guān)。YTHDF2結(jié)合m6A修飾的mRNA，招募CCR4-NOT去腺苷酸酶復(fù)合體，并定位于RNA處理體以促進(jìn)mRNA降解。YTHDF3可以調(diào)控m6A修飾RNA的翻譯和降解。
YTHDC1和YTHDC2是定位于細(xì)胞核的m6A“reader”蛋白。YTHDC1通過與剪切和出核因子SRSF3的互作調(diào)控pre-mRNA剪切和出核，其功能與多種疾病相關(guān)。YTHDC2調(diào)控m6A修飾RNA的翻譯和降解，并在調(diào)控精子發(fā)生中的有絲分裂到減數(shù)分裂的轉(zhuǎn)換中發(fā)揮作用。
非選擇性YTHDF抑制劑ebselen(圖4e)通過監(jiān)測化合物對YTH結(jié)構(gòu)域色氨酸熒光猝滅效應(yīng)發(fā)現(xiàn)。Salvianolic acid C是首個YTHDF1靶向抑制劑，其與YTHDF1的結(jié)合親和力（Kd）為5-6μM。DC-Y13-27(圖4e)是通過篩選發(fā)現(xiàn)的YTHDF2抑制劑，其IC50為21.8 μM。這些抑制劑通過影響YTHDF家族蛋白的功能來調(diào)控m6A修飾RNA命運(yùn)。
IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3是另一種m6A結(jié)合蛋白家族。這些蛋白通過穩(wěn)定m6A修飾RNA并促進(jìn)其翻譯來發(fā)揮功能。例如，BTYNB是IGF2BP1的抑制劑，其通過阻止IGF2BP1與MYC mRNA的結(jié)合來抑制黑色素瘤和卵巢癌細(xì)胞增殖。CWI1-2是IGF2BP2的抑制劑，其通過阻止IGF2BP2與RNA的結(jié)合來抑制AML細(xì)胞增殖。
m7G的分布與功能
m7G修飾存在于各種RNA種類中，包括tRNA、mRNA和核糖體RNA(rRNA；表1)。在tRNA中，m7G甲基化高度保守，通常位于第46位。m7G與相鄰核苷酸相互作用產(chǎn)生正電荷并穩(wěn)定tRNA結(jié)構(gòu)以減少核糖體暫停，從而維持翻譯效率。在mRNA上，m7G在mRNA 5'端加帽過程中沉積，隨后m7G與帽結(jié)合復(fù)合體和翻譯起始因子eIF4E互作促進(jìn)RNA剪切、出核和翻譯。哺乳動物RNA也可以有內(nèi)部m7G修飾，以帽m7G獨(dú)立機(jī)制調(diào)控翻譯。RBP quaking 7(QKI-7)已被表征為內(nèi)部m7G的reader蛋白之一。過表達(dá)QKI-7促進(jìn)化療應(yīng)激期間m7G標(biāo)記mRNA在應(yīng)激顆粒中的定位，并使癌細(xì)胞對阿霉素治療敏感。在miRNA上，內(nèi)部m7G修飾通過防止二級結(jié)構(gòu)促進(jìn)miRNA加工。
m7G修飾的調(diào)控蛋白
在人類細(xì)胞中，METTL1及其輔助因子WD重復(fù)域4（WDR4）形成催化tRNA和某些mRNA上m7G的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體。METTL1和WDR4通過增加tRNA m7G甲基化和tRNA豐度來驅(qū)動腫瘤進(jìn)展。例如，在肝細(xì)胞癌（HCC）中，WDR4通過增加tRNA m7G甲基化和促進(jìn)CCNB1轉(zhuǎn)錄本的翻譯來促進(jìn)PI3K和AKT磷酸化以及P53的泛素化和降解。
高M(jìn)ETTL1表達(dá)水平與癌癥患者的不良生存相關(guān)，敲低各種癌細(xì)胞系中的METTL1抑制細(xì)胞生長和腫瘤發(fā)生。Arg-TCT RNA和METTL1在AML和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中都表現(xiàn)出致癌作用。METTL1通過tRNA m7G調(diào)控mRNA技術(shù)的致癌作用也在肺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和肝癌中有報(bào)道。
METTL1也可能通過miRNA上的m7G修飾以調(diào)控加工，從而發(fā)揮腫瘤抑制作用，如一項(xiàng)肺癌的研究結(jié)果表明不同RNA種類上的m7G可能具有不同效應(yīng)。METTL1過表達(dá)可以使腫瘤細(xì)胞對順鉑治療敏感。
m7G修飾的抑制劑
METTL1和WDR4的致癌作用使它們成為癌癥的潛在治療靶點(diǎn)，但目前尚無靶向METTL1或WDR4的抑制劑。設(shè)計(jì)靶向METTL1-SAM結(jié)合口袋關(guān)鍵殘基的小分子作為未來的研究方向，可能顯示出抑制效果，但需要具有選擇性以避免抑制其它基于SAM的酶。或者設(shè)計(jì)破壞METTL1-WDR4相互作用的抑制劑，以METTL1-WDR4復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)為指導(dǎo)。在METTL1抑制對疾病結(jié)果不利的情況下，鑒定m7G結(jié)合蛋白可能揭示更多治療靶點(diǎn)。
5-甲基胞嘧啶（m5C）
m5C的分布與功能
m5C修飾廣泛存在于各種RNA種類中，包括mRNA、tRNA、rRNA、長鏈非編碼（lncRNA）和miRNA(表1)。NSUN家族蛋白和TRDMT1是m5C修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶，這些修飾可增加tRNA和mRNA的穩(wěn)定性，調(diào)控蛋白合成。具體而言，NSUN2、NSUN6和TRDMT1甲基化tRNA m5C，調(diào)控密碼子識別從而調(diào)控蛋白合成。在rRNA中，m5C修飾的NSUN1和NSUN5對三級結(jié)構(gòu)和核糖體生物發(fā)生很重要。NSUN2、NSUN3和NSUN4介導(dǎo)的線粒體m5C RNA甲基化調(diào)控線粒體翻譯。mRNA在編碼序列中有豐富的m5C修飾，阻礙翻譯效率但增強(qiáng)mRNA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的出核。
m5C修飾的調(diào)控蛋白
NSUN2是研究最為廣泛的m5C甲基轉(zhuǎn)移酶。NSUN2表達(dá)和tRNA、mRNA和lncRNA上的m5C修飾在多種癌癥中上調(diào)，并與不良預(yù)后相關(guān)。例如，在HCC細(xì)胞中，NSUN2高表達(dá)通過穩(wěn)定H19 lncRNA來促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。已顯示其具有致癌功能。沉默NSUN2降低了RNA m5C總豐度并抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。由于其在甲基化tRNA中的活性，功能NSUN2的缺乏也導(dǎo)致tRNA不穩(wěn)定，并與智力障礙和細(xì)胞對應(yīng)激反應(yīng)的敏感化相關(guān)。
甲基轉(zhuǎn)移酶TRDMT1催化tRNA m5C甲基化，并在DNA損傷位點(diǎn)促進(jìn)RNA在DNA：RNA雜合體上的甲基化。這些甲基化位點(diǎn)被m5C reader蛋白RAD52結(jié)合以啟動同源重組DNA修復(fù)通路。抑制TRDMT1-RAD52軸誘導(dǎo)凋亡，并使癌細(xì)胞對放療和PARP抑制劑敏感。靶向TRDMT1可以為同源重組缺陷癌癥提供替代治療策略。
除了RAD52和FMRP，m5C還被兩種reader蛋白ALYREF和YBX1富集。ALYREF結(jié)合mRNA m5C并促進(jìn)其靶標(biāo)的出核。它在HCC、膀胱癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中高表達(dá)。在這些癌組織中，ALYREF似乎穩(wěn)定并維持甲基化致癌轉(zhuǎn)錄本如MYC和PKM2表達(dá)，敲低ALYREF抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長和體內(nèi)腫瘤形成。靶向ALYREF的小分子可能對各種癌癥，特別是MYC驅(qū)動的癌癥具有臨床價值。在病毒感染中，ALYREF出核m5C甲基化病毒RNA并增加逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制。因此，ALYREF抑制劑也可能具有阻礙病毒感染的潛力。
YBX1是另一種m5C結(jié)合蛋白，在膀胱癌中高度表達(dá)，且與膀胱癌進(jìn)展呈正相關(guān)。YBX1通過招募RNA穩(wěn)定劑ELAVL1來穩(wěn)定m5C高度甲基化的致癌轉(zhuǎn)錄本HDGF促進(jìn)腫瘤發(fā)生。
m5C修飾蛋白的臨床靶向潛力
由于NSUN2在多種癌癥中的表達(dá)上調(diào)和其對腫瘤進(jìn)展的促進(jìn)作用，使其成為潛在的治療靶點(diǎn)。然而，目前尚未有靶向NSUN2的抑制劑被開發(fā)出來。此外，TRDMT1在DNA損傷修復(fù)以及癌癥治療中的潛在作用也為其作為治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)，尤其是在同源重組缺陷型癌癥中，但目前同樣缺乏靶向TRDMT1的特異性抑制劑。
N1 -甲基腺苷（m1A）
m1A修飾的存在及其作用
m1A修飾存在于tRNA、mRNA、rRNA和lncRNA中(表1)，其在tRNA上的存在有助于維持tRNA穩(wěn)定性以及調(diào)控翻譯的起始和延伸過程。在mRNA上，m1A修飾主要富集在5′非翻譯區(qū)（5′UTR），與替代翻譯起始位點(diǎn)相關(guān)。
m1A修飾酶及其與癌癥的關(guān)聯(lián)
TRMT6-TRMT61A復(fù)合體、TRMT61B以及TRMT10C是以各種RNA為底物的m1A甲基轉(zhuǎn)移酶（writers）。TRMT6、TRMT61A或TRMT61B的高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)。此外，在肝細(xì)胞癌（HCC）中也觀察到TRMT6和TRMT61A mRNA的高表達(dá)以及m1A豐度增加。
具體而言，TRMT6-TRMT61A對PPARG mRNA的m1A58修飾確保其適當(dāng)翻譯，PPARG調(diào)控膽固醇生物合成并激活Hedgehog信號。抑制TRMT6-TRMT61A通過調(diào)控PPARG翻譯抑制HCC腫瘤發(fā)生。
目前已鑒定出幾種m1A去甲基化酶（erasers），其中研究最多的是ALKBH1酶，在大多數(shù)tRNA中去甲基化m1A58。這種m1A58去甲基化導(dǎo)致起始甲硫氨酸t(yī)RNA降解，ALKBH1缺失增加起始甲硫氨酸t(yī)RNA穩(wěn)定性和翻譯效率。ALKBH1在患病組織中異常表達(dá)，但尚未深入研究其機(jī)制。在胰腺癌患者中，ALKBH1基因表達(dá)水平與不良預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。ALKBH1表達(dá)水平也與心血管疾病相關(guān)；然而，這種關(guān)聯(lián)是否是m1A依賴的尚不清楚。
ALKBH3去甲基化DNA和RNA上的m1A，對rRNA、tRNA和mRNA有活性。由于ALKBH3缺失導(dǎo)致的tRNA上m1A積累減少了蛋白合成。敲低ALKBH3也抑制癌細(xì)胞增殖。在卵巢癌和乳腺癌中，ALKBH3水平升高，該蛋白去甲基化細(xì)胞因子CSF-1的mRNA。結(jié)果，CSF-1 mRNA的半衰期延長，CSF-1蛋白水平升高促進(jìn)轉(zhuǎn)移和侵襲。ALKBH1和ALKBH3水平與膠質(zhì)瘤患者的不良生存相關(guān)。
總體而言，m1A依賴性RNA調(diào)控在細(xì)胞過程和疾病發(fā)病機(jī)制中具有作用，表明靶向m1A甲基化酶和去甲基化酶的潛力。未來開發(fā)靶向這些酶的選擇性和強(qiáng)效小分子抑制劑將能夠在各種治療領(lǐng)域驗(yàn)證這些假設(shè)。
m1A相關(guān)抑制劑的應(yīng)用前景
在篩選破壞TRMT6-TRMT61A復(fù)合物形成的抑制劑時，鑒定出抗菌藥物四甲基秋蘭姆二硫化物(thiram)(圖4g)。thiram抑制肝臟腫瘤生長并特異性降低m1A豐度，證明靶向m1A writers酶用于癌癥治療的潛力。
假尿苷（Ψ）
Ψ分布與功能
Ψ是尿苷的異構(gòu)體，是第一個被發(fā)現(xiàn)的RNA修飾，也是最豐富的RNA修飾。Ψ廣泛存在于rRNA和tRNA中(表1)。雖然豐度較低，Ψ也存在于其它RNA種類中，包括miRNA和mRNA。rRNA上的假尿苷主要分布在核糖體的功能區(qū)域，如肽酰轉(zhuǎn)移酶中心、解碼區(qū)域等。這些位點(diǎn)假尿苷的缺失會干擾翻譯或核糖體生物發(fā)生。tRNA和mRNA上的Ψ同樣調(diào)控翻譯。高度保守的tRNA假尿苷化，以及在反密碼子莖和環(huán)區(qū)域，調(diào)控與密碼子的堿基配對。mRNA終止密碼子UAA、UAG或UGA的假尿苷化導(dǎo)致終止密碼子通讀。snRNA中的假尿苷可以調(diào)控剪切。
Ψ修飾與疾病關(guān)聯(lián)
假尿苷化可以直接由假尿苷合成酶(PUS)酶催化，或由DKC1催化，DKC1由具有H/ACA motif的snoRNA引導(dǎo)。mRNA的假尿苷化在熱休克和應(yīng)激反應(yīng)中動態(tài)調(diào)控，但疾病刺激是否導(dǎo)致不同的假尿苷模式需要進(jìn)一步研究。然而，研究支持修飾失調(diào)與疾病相關(guān)的觀點(diǎn)。
假尿苷化被認(rèn)為與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，如與MYC表達(dá)水平相關(guān)的snoRNA SCARNA15表達(dá)，其通過引導(dǎo)假尿苷化調(diào)控腫瘤抑制基因剪切和癌細(xì)胞生長。
Ψ修飾酶的抑制與治療潛力
通過監(jiān)測假尿苷水平，鑒定出小分子C17作為PUS7催化活性的抑制劑，C17能在納摩爾濃度下抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞（GSC）的生長，并在小鼠中抑制腫瘤生長，這表明靶向PUS酶的抑制劑開發(fā)對于癌癥治療具有潛在的應(yīng)用價值。
2′-O-甲基化（Nm）
Nm修飾分布及功能
Nm表示對任何一種核糖核苷酸的2′-羥基的甲基化，存在于tRNA、rRNA、snRNA、小非編碼RNA和mRNA中(表1)。與核堿基修飾不同，Nm不直接干擾Watson-Crick堿基配對。然而，Nm修飾保護(hù)RNA免受核酸酶活性，增強(qiáng)RNA-RNA互作，破壞RNA-蛋白質(zhì)互作并干擾RNA三級結(jié)構(gòu)。因此，Nm對調(diào)控RNA穩(wěn)定性、翻譯和剪切非常重要。
Nm修飾與疾病關(guān)聯(lián)
FTSJ1編碼的tRNA Nm甲基轉(zhuǎn)移酶與X連鎖智力障礙有關(guān)，而FBL（Fibrillarin）這種在rRNA甲基化中起作用的甲基轉(zhuǎn)移酶在多種癌癥中過表達(dá)，可能有助于腫瘤細(xì)胞的生長。
Nm修飾在區(qū)分自身和非自身轉(zhuǎn)錄本方面也起著重要的作用，例如，在mRNA生物合成過程中，由CMTR1和CMTR2這兩個帽子甲基轉(zhuǎn)移酶依次進(jìn)行的Nm修飾能夠防止先天免疫反應(yīng)對自身RNA的攻擊。
Nm修飾相關(guān)抑制劑的開發(fā)
盡管Nm修飾在多種疾病中具有重要意義，然而，靶向調(diào)控Nm修飾蛋白的抑制劑的開發(fā)仍然有限。開發(fā)具有選擇性的抑制劑有望為智力障礙、癌癥和病毒感染等疾病的治療提供新的應(yīng)用方向。
機(jī)遇與挑戰(zhàn)
目前，越來越多的證據(jù)表明，模式生物上的多種RNA修飾在各類疾病中均具有顯著作用，這些發(fā)現(xiàn)為治療靶點(diǎn)開辟了一個新的道路，m6A修飾通路在癌癥中的作用及其在腫瘤微環(huán)境（TME）中的調(diào)控作用表明，其可能具有抗腫瘤益處，且有一定概率改善癌癥治療的效果，尤其是針對治療的耐藥性方面。
干細(xì)胞治療是另一個可能從抑制m6A效應(yīng)蛋白的藥物中受益的領(lǐng)域，m6A修飾通過影響YTHDF2對轉(zhuǎn)錄本的快速降解來調(diào)控干細(xì)胞的自我更新和分化，靶向m6A通路可能為克服治療用干細(xì)胞擴(kuò)增提供機(jī)會。
盡管RNA修飾作為治療靶點(diǎn)具有巨大潛力，但在將研究得出的小分子藥物應(yīng)用于臨床仍面臨挑戰(zhàn)，例如，靶向RNA修飾蛋白的小分子藥物可能需要在特定的時間窗口內(nèi)給藥，原因是RNA修飾的功能高度依賴于給藥背景。此外，RNA修飾和RNA結(jié)合蛋白通常具有相似的催化結(jié)構(gòu)域或結(jié)合口袋，這使得開發(fā)特異性抑制劑變得具有挑戰(zhàn)性，在設(shè)計(jì)小分子時需要考慮如何實(shí)現(xiàn)對特定底物結(jié)合域的干擾，以實(shí)現(xiàn)特異性抑制。
RNA治療領(lǐng)域的進(jìn)展表明，了解不同RNA修飾功能可以對合成RNA分子進(jìn)行加工，以實(shí)現(xiàn)某些化學(xué)和生物學(xué)特性。例如，包括m6A、Ψ、m5C和mRNA 5′端帽子上的m7G等在內(nèi)的多種RNA修飾可以減輕免疫原性，同時增加翻譯效率，這些RNA修飾的發(fā)現(xiàn)為RNA治療藥物的開發(fā)和優(yōu)化提供了重要的指導(dǎo)。
參考文獻(xiàn)：
Zhang L, Wei J, Zou Z, He C. RNA modification systems as therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 2025 Sep 17. doi: 10.1038/s41573-025-01280-8.
RNA修飾、調(diào)控蛋白及分子功能
在眾多RNA修飾中，N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)、N7-甲基鳥苷(N7-methylguanosine, m7G)、5-甲基胞苷(5-methylcytosine, m5C) 、N1-甲基腺苷(N1-methyladenosine, m1A)、假尿苷(Ψ)和2'-O-甲基化(2'-O-methylation, Nm)是調(diào)控基因表達(dá)和細(xì)胞生物學(xué)過程的關(guān)鍵化學(xué)標(biāo)記。與表觀基因組修飾類似，RNA修飾在不改變DNA或RNA序列的情況下對基因表達(dá)存在關(guān)鍵作用。
RNA修飾可以在共轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后添加，導(dǎo)致RNA結(jié)構(gòu)、加工、翻譯及降解的改變(表1)。這些功能由識別并結(jié)合修飾的RNA結(jié)合蛋白(RBPs，"readers")介導(dǎo)。除了RNA代謝和翻譯，RNA修飾還可以調(diào)控RNA:DNA雜合體形成，參與影響全局染色質(zhì)狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄。
此外，基于RNA修飾作用的多種關(guān)鍵生物通路與疾病的關(guān)聯(lián)正在逐步解析，如RNA修飾調(diào)控癌癥中的致癌通路，STM2457是第一個設(shè)計(jì)用于抑制RNA修飾酶催化活性的小分子，它能抑制m6A writer酶METTL3，在抑制急性髓性白血病(AML)小鼠模型中植入和擴(kuò)增，成功證明了靶向RNA修飾酶治療癌癥的潛力。這項(xiàng)研究開發(fā)的首個影響RNA修飾酶的候選藥物已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。令人意外的，一些已獲批的藥物也被發(fā)現(xiàn)是RNA修飾的有效調(diào)控劑，如帕金森病藥物安托卡朋(antecapone)被發(fā)現(xiàn)能抑制m6A去甲基酶FTO。綜上，這些進(jìn)展突顯了靶向RNA修飾治療疾病的潛力。
表1：RNA修飾、調(diào)控蛋白及分子功能
N6-甲基腺苷（m6A））
m6A是哺乳動物中最豐富的RNA修飾。平均每個哺乳動物轉(zhuǎn)錄本有三個m6A修飾，位于RRm6ACH(R=A/G;H=A/C/U)的共有序列中。m6A甲基化盡管發(fā)生在mRNA的各個區(qū)域，但在3'非翻譯區(qū)(UTR)和靠近終止密碼子處富集。m6A甲基化由"甲基轉(zhuǎn)移酶(writers)"METTL3和METTL14沉積，可被"去甲基化酶(erasers)"FTO和ALKBH5去除。m6A修飾的RNA通過與RNA結(jié)合蛋白來調(diào)控RNA代謝，包括加工、運(yùn)輸、翻譯及穩(wěn)定性（圖1），這些調(diào)控功能已在多種生物系統(tǒng)中得到了廣泛研究，m6A調(diào)控多種過程，如干細(xì)胞分化、組織發(fā)育、信號通路、應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)功能、病毒感染和代謝等，m6A失調(diào)與癌癥、免疫穩(wěn)態(tài)、代謝疾病和神經(jīng)紊亂相關(guān)。
圖1：m6A修飾及其調(diào)控蛋白。
- RNA m6A）甲基化由包含METTL3和METTL14的m6A“writers”復(fù)合體催化，且可被erasers蛋白FTO和ALKBH5去除。
- m6A修飾可被細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的選擇性結(jié)合蛋白（“readers”）識別，包括YTHDF1/2/3、YTHDC1/2、IGF2BP1/2/3和FMRP。HNRNPA2B1、HNRNPC和HNRNPG可識別并結(jié)合因m6A甲基化而二級結(jié)構(gòu)弱化的RNA區(qū)域。通過這些reader蛋白，m6A修飾可調(diào)控RNA加工和代謝的諸多方面。
METTL3、METTL14和調(diào)控亞基WTAP是沉積m6A的主要RNA甲基轉(zhuǎn)移酶"writers"復(fù)合體的關(guān)鍵組分，其中METTL3和METTL14形成核心穩(wěn)定的異源二聚體。METTL3表現(xiàn)出催化活性并結(jié)合甲基供體S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，而METTL14穩(wěn)定甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物以促進(jìn)RNA結(jié)合和甲基化。
m6A mRNA甲基化可通過影響RNA翻譯和穩(wěn)定性影響許多致癌通路(圖2)。例如，約1.5%的子宮內(nèi)膜癌患者在METTL14中有R298P突變殘基，與鄰近正常組織相比，大部分子宮內(nèi)膜癌中METTL3下調(diào)，導(dǎo)致m6A甲基化水平低。由此導(dǎo)致的PHLPP2 mRNA低甲基化降低了這種AKT激酶負(fù)調(diào)控因子的翻譯，而對mTORC2組分編碼mRNA的低甲基化抑制了mRNA衰變并增加mTORC2表達(dá)。結(jié)果，AKT通路被激活，刺激子宮內(nèi)膜癌的增殖和腫瘤發(fā)生。METTL14的純合R298P突變將其基序偏好從[G/A][G/A]ACU轉(zhuǎn)變?yōu)镚l[A][C/U]U。雖然METTL14變化確實(shí)導(dǎo)致mRNA整體甲基化減少，但在非經(jīng)典位點(diǎn)觀察到m6A甲基化增加。
p53通路也受m6A調(diào)控(圖2b)。METTL3-METTL14復(fù)合體甲基化編碼p53抑制因子MDM2的mRNA。METTL3和METTL14在AML中表達(dá)均升高。與健康個體相比，AML患者中MDM2 mRNA高度甲基化，增加了MDM2蛋白表達(dá)并抑制p53信號。METTL3還與MDM2競爭p53結(jié)合，從而穩(wěn)定p53。p53與METTL3互作促進(jìn)METTL3介導(dǎo)的m6A甲基化，進(jìn)而形成正反饋回路。
此外，調(diào)控m6A修飾或許能成為抗感染、調(diào)控免疫反應(yīng)以及增強(qiáng)免疫治療效果的新策略（圖3）。
圖2：受m6A調(diào)控的信號通路。
- m6A修飾通過多種機(jī)制調(diào)控AKT通路，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖與分化。在子宮內(nèi)膜癌中，因METTL14突變或METTL3表達(dá)下調(diào)，PHLPP2轉(zhuǎn)錄本以及編碼mTORC2組分的轉(zhuǎn)錄本上m6A水平降低，導(dǎo)致PHLPP2翻譯減少，mTORC2組分轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性增加，從而激活A(yù)KT信號通路。在急性髓性白血�。╝cute myelogenous leukemia，AML）中，METTL3表達(dá)升高使PTEN mRNA m6A甲基化增加，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄本翻譯。PTEN表達(dá)升高抑制AKT信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞存活與增殖。
- METTL3在調(diào)控p53通路中發(fā)揮相反作用。它使編碼E3泛素連接酶MDM2（p53的負(fù)向調(diào)控因子）的轉(zhuǎn)錄本發(fā)生甲基化。MDM2 mRNA的甲基化提高其翻譯效率，抑制p53信號通路，進(jìn)而抑制細(xì)胞分化與凋亡。METTL3還與MDM2競爭p53結(jié)合位點(diǎn)，從而促進(jìn)p53信號通路及其抑癌功能。
- 在JAK - STAT通路中，SOCS2、JAK1和STAT1的轉(zhuǎn)錄本受m6A甲基化調(diào)控。在肝癌細(xì)胞中，編碼JAK負(fù)向調(diào)控因子SOCS2的轉(zhuǎn)錄本發(fā)生甲基化，加速mRNA降解，激活JAK信號通路以支持細(xì)胞增殖。JAK1和STAT1 mRNA甲基化促進(jìn)這些轉(zhuǎn)錄本降解，抑制JAK-STAT信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞分化減少與細(xì)胞因子應(yīng)答降低。
圖3：靶向RNA修飾的潛在治療應(yīng)用。靶向RNA修飾效應(yīng)蛋白具有極具前景的臨床價值。
- m6A甲基化及其效應(yīng)蛋白（包括METTL3、METTL14、ALKBH5、YTHDF1和YTHDF2）已被報(bào)道有助于調(diào)控免疫細(xì)胞功能并維持穩(wěn)態(tài)，且在自身免疫疾病中發(fā)生改變。
- 多種RNA修飾及其相應(yīng)的效應(yīng)蛋白參與對病毒感染的免疫反應(yīng)。例如YTHDF3抑制抗病毒免疫反應(yīng)并促進(jìn)病毒感染。抑制YTHDF3可能是傳統(tǒng)抗病毒藥物的替代選擇。
- 靶向RNA修飾可能會使腫瘤對抗PD-1或抗PD-L1免疫治療具有高靈敏度。例如與YTHDF2抑制劑聯(lián)合使用可增強(qiáng)放療和抗PD - L1治療的療效。
- 調(diào)控m6A效應(yīng)蛋白可能會使癌細(xì)胞對化療藥物高靈敏度。例如使用FTO抑制劑可能會使白血病細(xì)胞對酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）敏感并克服藥物耐受性，提供比單獨(dú)TKI治療更好的療效。
- m6A甲基化效應(yīng)蛋白如METTL3/14和YTHDF2，可能有助于在干細(xì)胞治療應(yīng)用過程中維持干細(xì)胞的干性或促進(jìn)其分化。靶向YTHDF2或相關(guān)因子的抑制劑可能會促進(jìn)干細(xì)胞擴(kuò)增，同時將惡性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)降至最低。
- YTHDF蛋白連同結(jié)合的RNA能夠形成與神經(jīng)性疾病相關(guān)的相分離凝聚體。靶向YTHDF蛋白可能會抑制凝聚體形成，從而利于疾病治療。
圖4：靶向RNA修飾“writer”、“eraser”和“reader”蛋白的抑制劑。
- 抑制METTL3的化合物。
- 激活m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的化合物。
- 抑制FTO的化合物。
- 抑制ALKBH5的化合物。
- 抑制YTHDF蛋白的化合物。
- 抑制IGF2BP蛋白的化合物。
- 靶向TRMT6/61A復(fù)合體的抑制劑。
FTO(肥胖相關(guān)基因，fat-mass and obesity-associated gene)和ALKBH5(AlkB同源蛋白5)是m6A去甲基化酶，能去除mRNA上的m6A修飾。FTO在多種癌癥中過表達(dá)，包括AML、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和乳腺癌，與不良預(yù)后相關(guān)。FTO通過去甲基化致癌轉(zhuǎn)錄本如MYC、BCL2和CEBPA促進(jìn)腫瘤發(fā)生。ALKBH5在缺氧條件下被誘導(dǎo)，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞、AML和乳腺癌中高表達(dá)，通過調(diào)控NANOG等干細(xì)胞因子維持癌癥干細(xì)胞特性。
ALKBH5也參與免疫細(xì)胞代謝。DEAD-box(DDX)解旋酶招募ALKBH5去甲基化m6A標(biāo)記的抗病毒轉(zhuǎn)錄本，抑制病毒感染后I型干擾素的產(chǎn)生。雙鏈DNA或人巨細(xì)胞病毒觸發(fā)的I型干擾素產(chǎn)生也受ALKBH5調(diào)控。此外，ALKBH5可以通過m6A去甲基化上調(diào)α-酮戊二酸脫氫酶(OGDH)mRNA，促進(jìn)先天免疫反應(yīng)非依賴性病毒復(fù)制。ALKBH5在T細(xì)胞激活時上調(diào)，并能調(diào)控CD4+ T細(xì)胞在自身免疫中的致病性。此外，ALKBH5在塑造腫瘤微環(huán)境(TME)中起關(guān)鍵作用，主要抑制抗癌免疫。
基于FTO在癌癥中的機(jī)制研究和可用的晶體結(jié)構(gòu)，已開發(fā)出多種小分子抑制劑(圖4c)。例如，2012年通過基于結(jié)構(gòu)的高通量篩選，發(fā)現(xiàn)了天然產(chǎn)物大黃素（rhein）作為FTO抑制劑，其在體外與FTO活性位點(diǎn)競爭性結(jié)合，Kd為2.4 μM。大黃素在白血病細(xì)胞中的IC50為21 μM，其對TKI耐藥細(xì)胞的應(yīng)用可恢復(fù)對TKI的敏感性。MO-I-500是另一種FTO抑制劑，其通過模擬維生素C的結(jié)構(gòu)來誘導(dǎo)一大類Fe(II)-依賴和2-氧戊二酸（2OG）-依賴雙加氧酶的活性。MO-I-500在體外對純化的FTO的IC50為8.7 μM，并在三陰性乳腺癌細(xì)胞中抑制其增殖。盡管大黃素和MO-I-500缺乏對FTO的選擇性，但2OG類似物compound 12顯示出對FTO約30倍的選擇性，其在HeLa細(xì)胞中的應(yīng)用導(dǎo)致mRNA m6A劑量依賴性增加。另一種天然致癌代謝產(chǎn)物R-2HG也顯示出對FTO的廣泛抗腫瘤效果。
通過基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)了ALKBH5抑制劑。例如，通過基于晶體結(jié)構(gòu)的虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)了化合物3和化合物6，它們在體外對ALKBH5的抑制作用分別為IC50=0.84 μM和1.79 μM。最近，通過高通量熒光偏振測定法揭示了一類新的ALKBH5抑制劑，具有1-芳基-1H-吡唑骨架，其中化合物20m顯示出對ALKBH5超過1000倍的選擇性，IC50為0.021 μM。
YTH結(jié)構(gòu)域蛋白作為m6A reader蛋白及其抑制劑
m6A調(diào)控在很大程度上依賴于其結(jié)合蛋白。研究最深入的reader蛋白YTS521-B同源(YTH)結(jié)構(gòu)域的家族蛋白YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1和YTHDC2。這些蛋白通過識別和結(jié)合m6A修飾的RNA來調(diào)控m6A修飾RNA命運(yùn)。YTHDF1促進(jìn)其m6A靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本翻譯，YTHDF1在多種患者腫瘤中表達(dá)升高，并與不良預(yù)后相關(guān)。YTHDF2結(jié)合m6A修飾的mRNA，招募CCR4-NOT去腺苷酸酶復(fù)合體，并定位于RNA處理體以促進(jìn)mRNA降解。YTHDF3可以調(diào)控m6A修飾RNA的翻譯和降解。
YTHDC1和YTHDC2是定位于細(xì)胞核的m6A“reader”蛋白。YTHDC1通過與剪切和出核因子SRSF3的互作調(diào)控pre-mRNA剪切和出核，其功能與多種疾病相關(guān)。YTHDC2調(diào)控m6A修飾RNA的翻譯和降解，并在調(diào)控精子發(fā)生中的有絲分裂到減數(shù)分裂的轉(zhuǎn)換中發(fā)揮作用。
非選擇性YTHDF抑制劑ebselen(圖4e)通過監(jiān)測化合物對YTH結(jié)構(gòu)域色氨酸熒光猝滅效應(yīng)發(fā)現(xiàn)。Salvianolic acid C是首個YTHDF1靶向抑制劑，其與YTHDF1的結(jié)合親和力（Kd）為5-6μM。DC-Y13-27(圖4e)是通過篩選發(fā)現(xiàn)的YTHDF2抑制劑，其IC50為21.8 μM。這些抑制劑通過影響YTHDF家族蛋白的功能來調(diào)控m6A修飾RNA命運(yùn)。
IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3是另一種m6A結(jié)合蛋白家族。這些蛋白通過穩(wěn)定m6A修飾RNA并促進(jìn)其翻譯來發(fā)揮功能。例如，BTYNB是IGF2BP1的抑制劑，其通過阻止IGF2BP1與MYC mRNA的結(jié)合來抑制黑色素瘤和卵巢癌細(xì)胞增殖。CWI1-2是IGF2BP2的抑制劑，其通過阻止IGF2BP2與RNA的結(jié)合來抑制AML細(xì)胞增殖。
圖5：靶向m6A“writer”、“eraser”和“reader”蛋白的抑制劑可抑制小鼠AML。
- m6A“writer”METTL3可修飾SP1、MYC和HOXA10等轉(zhuǎn)錄本，促進(jìn)其翻譯，從而支持急性髓系白血�。ˋML）細(xì)胞的存活與增殖。METTL3抑制劑STM2457能夠抑制這些轉(zhuǎn)錄本的甲基化，進(jìn)而阻斷m6A介導(dǎo)的翻譯過程，抑制AML細(xì)胞的增殖。在患者來源異種移植（PDX）小鼠模型中，STM2457給藥可減少腫瘤生長，延長生存期。
- m6A“eraser”FTO可穩(wěn)定ASB2、RARA、MYC和CEBPA等轉(zhuǎn)錄本，從而促進(jìn)AML細(xì)胞增殖。FTO抑制劑FB23-2可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄本上m6A積累，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本降解。在小鼠PDX模型中，F(xiàn)B23-2給藥可減少腫瘤生長，延長生存期。
- m6A“reader”IGF2BP2可穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄本并促進(jìn)翻譯，以支持AML中的谷氨酰胺代謝。抑制劑CWI1-2可阻止IGF2BP2與RNA結(jié)合，減少其對致癌轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定作用。在攜帶小鼠AML細(xì)胞系C1498的二次骨髓移植同種異體小鼠模型中，CWI1-2可減少腫瘤生長，延長生存期。
m7G的分布與功能
m7G修飾存在于各種RNA種類中，包括tRNA、mRNA和核糖體RNA(rRNA；表1)。在tRNA中，m7G甲基化高度保守，通常位于第46位。m7G與相鄰核苷酸相互作用產(chǎn)生正電荷并穩(wěn)定tRNA結(jié)構(gòu)以減少核糖體暫停，從而維持翻譯效率。在mRNA上，m7G在mRNA 5'端加帽過程中沉積，隨后m7G與帽結(jié)合復(fù)合體和翻譯起始因子eIF4E互作促進(jìn)RNA剪切、出核和翻譯。哺乳動物RNA也可以有內(nèi)部m7G修飾，以帽m7G獨(dú)立機(jī)制調(diào)控翻譯。RBP quaking 7(QKI-7)已被表征為內(nèi)部m7G的reader蛋白之一。過表達(dá)QKI-7促進(jìn)化療應(yīng)激期間m7G標(biāo)記mRNA在應(yīng)激顆粒中的定位，并使癌細(xì)胞對阿霉素治療敏感。在miRNA上，內(nèi)部m7G修飾通過防止二級結(jié)構(gòu)促進(jìn)miRNA加工。
m7G修飾的調(diào)控蛋白
在人類細(xì)胞中，METTL1及其輔助因子WD重復(fù)域4（WDR4）形成催化tRNA和某些mRNA上m7G的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體。METTL1和WDR4通過增加tRNA m7G甲基化和tRNA豐度來驅(qū)動腫瘤進(jìn)展。例如，在肝細(xì)胞癌（HCC）中，WDR4通過增加tRNA m7G甲基化和促進(jìn)CCNB1轉(zhuǎn)錄本的翻譯來促進(jìn)PI3K和AKT磷酸化以及P53的泛素化和降解。
高M(jìn)ETTL1表達(dá)水平與癌癥患者的不良生存相關(guān)，敲低各種癌細(xì)胞系中的METTL1抑制細(xì)胞生長和腫瘤發(fā)生。Arg-TCT RNA和METTL1在AML和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中都表現(xiàn)出致癌作用。METTL1通過tRNA m7G調(diào)控mRNA技術(shù)的致癌作用也在肺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和肝癌中有報(bào)道。
METTL1也可能通過miRNA上的m7G修飾以調(diào)控加工，從而發(fā)揮腫瘤抑制作用，如一項(xiàng)肺癌的研究結(jié)果表明不同RNA種類上的m7G可能具有不同效應(yīng)。METTL1過表達(dá)可以使腫瘤細(xì)胞對順鉑治療敏感。
m7G修飾的抑制劑
METTL1和WDR4的致癌作用使它們成為癌癥的潛在治療靶點(diǎn)，但目前尚無靶向METTL1或WDR4的抑制劑。設(shè)計(jì)靶向METTL1-SAM結(jié)合口袋關(guān)鍵殘基的小分子作為未來的研究方向，可能顯示出抑制效果，但需要具有選擇性以避免抑制其它基于SAM的酶。或者設(shè)計(jì)破壞METTL1-WDR4相互作用的抑制劑，以METTL1-WDR4復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)為指導(dǎo)。在METTL1抑制對疾病結(jié)果不利的情況下，鑒定m7G結(jié)合蛋白可能揭示更多治療靶點(diǎn)。
5-甲基胞嘧啶（m5C）
m5C的分布與功能
m5C修飾廣泛存在于各種RNA種類中，包括mRNA、tRNA、rRNA、長鏈非編碼（lncRNA）和miRNA(表1)。NSUN家族蛋白和TRDMT1是m5C修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶，這些修飾可增加tRNA和mRNA的穩(wěn)定性，調(diào)控蛋白合成。具體而言，NSUN2、NSUN6和TRDMT1甲基化tRNA m5C，調(diào)控密碼子識別從而調(diào)控蛋白合成。在rRNA中，m5C修飾的NSUN1和NSUN5對三級結(jié)構(gòu)和核糖體生物發(fā)生很重要。NSUN2、NSUN3和NSUN4介導(dǎo)的線粒體m5C RNA甲基化調(diào)控線粒體翻譯。mRNA在編碼序列中有豐富的m5C修飾，阻礙翻譯效率但增強(qiáng)mRNA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的出核。
m5C修飾的調(diào)控蛋白
NSUN2是研究最為廣泛的m5C甲基轉(zhuǎn)移酶。NSUN2表達(dá)和tRNA、mRNA和lncRNA上的m5C修飾在多種癌癥中上調(diào)，并與不良預(yù)后相關(guān)。例如，在HCC細(xì)胞中，NSUN2高表達(dá)通過穩(wěn)定H19 lncRNA來促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。已顯示其具有致癌功能。沉默NSUN2降低了RNA m5C總豐度并抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。由于其在甲基化tRNA中的活性，功能NSUN2的缺乏也導(dǎo)致tRNA不穩(wěn)定，并與智力障礙和細(xì)胞對應(yīng)激反應(yīng)的敏感化相關(guān)。
甲基轉(zhuǎn)移酶TRDMT1催化tRNA m5C甲基化，并在DNA損傷位點(diǎn)促進(jìn)RNA在DNA：RNA雜合體上的甲基化。這些甲基化位點(diǎn)被m5C reader蛋白RAD52結(jié)合以啟動同源重組DNA修復(fù)通路。抑制TRDMT1-RAD52軸誘導(dǎo)凋亡，并使癌細(xì)胞對放療和PARP抑制劑敏感。靶向TRDMT1可以為同源重組缺陷癌癥提供替代治療策略。
除了RAD52和FMRP，m5C還被兩種reader蛋白ALYREF和YBX1富集。ALYREF結(jié)合mRNA m5C并促進(jìn)其靶標(biāo)的出核。它在HCC、膀胱癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中高表達(dá)。在這些癌組織中，ALYREF似乎穩(wěn)定并維持甲基化致癌轉(zhuǎn)錄本如MYC和PKM2表達(dá)，敲低ALYREF抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長和體內(nèi)腫瘤形成。靶向ALYREF的小分子可能對各種癌癥，特別是MYC驅(qū)動的癌癥具有臨床價值。在病毒感染中，ALYREF出核m5C甲基化病毒RNA并增加逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制。因此，ALYREF抑制劑也可能具有阻礙病毒感染的潛力。
YBX1是另一種m5C結(jié)合蛋白，在膀胱癌中高度表達(dá)，且與膀胱癌進(jìn)展呈正相關(guān)。YBX1通過招募RNA穩(wěn)定劑ELAVL1來穩(wěn)定m5C高度甲基化的致癌轉(zhuǎn)錄本HDGF促進(jìn)腫瘤發(fā)生。
m5C修飾蛋白的臨床靶向潛力
由于NSUN2在多種癌癥中的表達(dá)上調(diào)和其對腫瘤進(jìn)展的促進(jìn)作用，使其成為潛在的治療靶點(diǎn)。然而，目前尚未有靶向NSUN2的抑制劑被開發(fā)出來。此外，TRDMT1在DNA損傷修復(fù)以及癌癥治療中的潛在作用也為其作為治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)，尤其是在同源重組缺陷型癌癥中，但目前同樣缺乏靶向TRDMT1的特異性抑制劑。
N1 -甲基腺苷（m1A）
m1A修飾的存在及其作用
m1A修飾存在于tRNA、mRNA、rRNA和lncRNA中(表1)，其在tRNA上的存在有助于維持tRNA穩(wěn)定性以及調(diào)控翻譯的起始和延伸過程。在mRNA上，m1A修飾主要富集在5′非翻譯區(qū)（5′UTR），與替代翻譯起始位點(diǎn)相關(guān)。
m1A修飾酶及其與癌癥的關(guān)聯(lián)
TRMT6-TRMT61A復(fù)合體、TRMT61B以及TRMT10C是以各種RNA為底物的m1A甲基轉(zhuǎn)移酶（writers）。TRMT6、TRMT61A或TRMT61B的高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)。此外，在肝細(xì)胞癌（HCC）中也觀察到TRMT6和TRMT61A mRNA的高表達(dá)以及m1A豐度增加。
具體而言，TRMT6-TRMT61A對PPARG mRNA的m1A58修飾確保其適當(dāng)翻譯，PPARG調(diào)控膽固醇生物合成并激活Hedgehog信號。抑制TRMT6-TRMT61A通過調(diào)控PPARG翻譯抑制HCC腫瘤發(fā)生。
目前已鑒定出幾種m1A去甲基化酶（erasers），其中研究最多的是ALKBH1酶，在大多數(shù)tRNA中去甲基化m1A58。這種m1A58去甲基化導(dǎo)致起始甲硫氨酸t(yī)RNA降解，ALKBH1缺失增加起始甲硫氨酸t(yī)RNA穩(wěn)定性和翻譯效率。ALKBH1在患病組織中異常表達(dá)，但尚未深入研究其機(jī)制。在胰腺癌患者中，ALKBH1基因表達(dá)水平與不良預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。ALKBH1表達(dá)水平也與心血管疾病相關(guān)；然而，這種關(guān)聯(lián)是否是m1A依賴的尚不清楚。
ALKBH3去甲基化DNA和RNA上的m1A，對rRNA、tRNA和mRNA有活性。由于ALKBH3缺失導(dǎo)致的tRNA上m1A積累減少了蛋白合成。敲低ALKBH3也抑制癌細(xì)胞增殖。在卵巢癌和乳腺癌中，ALKBH3水平升高，該蛋白去甲基化細(xì)胞因子CSF-1的mRNA。結(jié)果，CSF-1 mRNA的半衰期延長，CSF-1蛋白水平升高促進(jìn)轉(zhuǎn)移和侵襲。ALKBH1和ALKBH3水平與膠質(zhì)瘤患者的不良生存相關(guān)。
總體而言，m1A依賴性RNA調(diào)控在細(xì)胞過程和疾病發(fā)病機(jī)制中具有作用，表明靶向m1A甲基化酶和去甲基化酶的潛力。未來開發(fā)靶向這些酶的選擇性和強(qiáng)效小分子抑制劑將能夠在各種治療領(lǐng)域驗(yàn)證這些假設(shè)。
m1A相關(guān)抑制劑的應(yīng)用前景
在篩選破壞TRMT6-TRMT61A復(fù)合物形成的抑制劑時，鑒定出抗菌藥物四甲基秋蘭姆二硫化物(thiram)(圖4g)。thiram抑制肝臟腫瘤生長并特異性降低m1A豐度，證明靶向m1A writers酶用于癌癥治療的潛力。
假尿苷（Ψ）
Ψ分布與功能
Ψ是尿苷的異構(gòu)體，是第一個被發(fā)現(xiàn)的RNA修飾，也是最豐富的RNA修飾。Ψ廣泛存在于rRNA和tRNA中(表1)。雖然豐度較低，Ψ也存在于其它RNA種類中，包括miRNA和mRNA。rRNA上的假尿苷主要分布在核糖體的功能區(qū)域，如肽酰轉(zhuǎn)移酶中心、解碼區(qū)域等。這些位點(diǎn)假尿苷的缺失會干擾翻譯或核糖體生物發(fā)生。tRNA和mRNA上的Ψ同樣調(diào)控翻譯。高度保守的tRNA假尿苷化，以及在反密碼子莖和環(huán)區(qū)域，調(diào)控與密碼子的堿基配對。mRNA終止密碼子UAA、UAG或UGA的假尿苷化導(dǎo)致終止密碼子通讀。snRNA中的假尿苷可以調(diào)控剪切。
Ψ修飾與疾病關(guān)聯(lián)
假尿苷化可以直接由假尿苷合成酶(PUS)酶催化，或由DKC1催化，DKC1由具有H/ACA motif的snoRNA引導(dǎo)。mRNA的假尿苷化在熱休克和應(yīng)激反應(yīng)中動態(tài)調(diào)控，但疾病刺激是否導(dǎo)致不同的假尿苷模式需要進(jìn)一步研究。然而，研究支持修飾失調(diào)與疾病相關(guān)的觀點(diǎn)。
假尿苷化被認(rèn)為與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，如與MYC表達(dá)水平相關(guān)的snoRNA SCARNA15表達(dá)，其通過引導(dǎo)假尿苷化調(diào)控腫瘤抑制基因剪切和癌細(xì)胞生長。
Ψ修飾酶的抑制與治療潛力
通過監(jiān)測假尿苷水平，鑒定出小分子C17作為PUS7催化活性的抑制劑，C17能在納摩爾濃度下抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞（GSC）的生長，并在小鼠中抑制腫瘤生長，這表明靶向PUS酶的抑制劑開發(fā)對于癌癥治療具有潛在的應(yīng)用價值。
2′-O-甲基化（Nm）
Nm修飾分布及功能
Nm表示對任何一種核糖核苷酸的2′-羥基的甲基化，存在于tRNA、rRNA、snRNA、小非編碼RNA和mRNA中(表1)。與核堿基修飾不同，Nm不直接干擾Watson-Crick堿基配對。然而，Nm修飾保護(hù)RNA免受核酸酶活性，增強(qiáng)RNA-RNA互作，破壞RNA-蛋白質(zhì)互作并干擾RNA三級結(jié)構(gòu)。因此，Nm對調(diào)控RNA穩(wěn)定性、翻譯和剪切非常重要。
Nm修飾與疾病關(guān)聯(lián)
FTSJ1編碼的tRNA Nm甲基轉(zhuǎn)移酶與X連鎖智力障礙有關(guān)，而FBL（Fibrillarin）這種在rRNA甲基化中起作用的甲基轉(zhuǎn)移酶在多種癌癥中過表達(dá)，可能有助于腫瘤細(xì)胞的生長。
Nm修飾在區(qū)分自身和非自身轉(zhuǎn)錄本方面也起著重要的作用，例如，在mRNA生物合成過程中，由CMTR1和CMTR2這兩個帽子甲基轉(zhuǎn)移酶依次進(jìn)行的Nm修飾能夠防止先天免疫反應(yīng)對自身RNA的攻擊。
Nm修飾相關(guān)抑制劑的開發(fā)
盡管Nm修飾在多種疾病中具有重要意義，然而，靶向調(diào)控Nm修飾蛋白的抑制劑的開發(fā)仍然有限。開發(fā)具有選擇性的抑制劑有望為智力障礙、癌癥和病毒感染等疾病的治療提供新的應(yīng)用方向。
機(jī)遇與挑戰(zhàn)
目前，越來越多的證據(jù)表明，模式生物上的多種RNA修飾在各類疾病中均具有顯著作用，這些發(fā)現(xiàn)為治療靶點(diǎn)開辟了一個新的道路，m6A修飾通路在癌癥中的作用及其在腫瘤微環(huán)境（TME）中的調(diào)控作用表明，其可能具有抗腫瘤益處，且有一定概率改善癌癥治療的效果，尤其是針對治療的耐藥性方面。
干細(xì)胞治療是另一個可能從抑制m6A效應(yīng)蛋白的藥物中受益的領(lǐng)域，m6A修飾通過影響YTHDF2對轉(zhuǎn)錄本的快速降解來調(diào)控干細(xì)胞的自我更新和分化，靶向m6A通路可能為克服治療用干細(xì)胞擴(kuò)增提供機(jī)會。
盡管RNA修飾作為治療靶點(diǎn)具有巨大潛力，但在將研究得出的小分子藥物應(yīng)用于臨床仍面臨挑戰(zhàn)，例如，靶向RNA修飾蛋白的小分子藥物可能需要在特定的時間窗口內(nèi)給藥，原因是RNA修飾的功能高度依賴于給藥背景。此外，RNA修飾和RNA結(jié)合蛋白通常具有相似的催化結(jié)構(gòu)域或結(jié)合口袋，這使得開發(fā)特異性抑制劑變得具有挑戰(zhàn)性，在設(shè)計(jì)小分子時需要考慮如何實(shí)現(xiàn)對特定底物結(jié)合域的干擾，以實(shí)現(xiàn)特異性抑制。
RNA治療領(lǐng)域的進(jìn)展表明，了解不同RNA修飾功能可以對合成RNA分子進(jìn)行加工，以實(shí)現(xiàn)某些化學(xué)和生物學(xué)特性。例如，包括m6A、Ψ、m5C和mRNA 5′端帽子上的m7G等在內(nèi)的多種RNA修飾可以減輕免疫原性，同時增加翻譯效率，這些RNA修飾的發(fā)現(xiàn)為RNA治療藥物的開發(fā)和優(yōu)化提供了重要的指導(dǎo)。
參考文獻(xiàn)：
Zhang L, Wei J, Zou Z, He C. RNA modification systems as therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 2025 Sep 17. doi: 10.1038/s41573-025-01280-8.
標(biāo)簽：
RNA甲基化
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