Western實(shí)驗(yàn)中Actin有多條帶的原因分析

Actin相信大家再熟悉不過(guò)了，無(wú)論做哪個(gè)蛋白的Western，它總是不離不棄，需要你一直帶著。它也是真核生物中含量最豐富的蛋白質(zhì)之一，含量豐富意味著容易檢測(cè)。大家回憶一下，第一次做Western是不是就是做的actin�？善�偏最簡(jiǎn)單的事情，卻很難每次都做出完美的條帶，總會(huì)出一些意想不到的結(jié)果。

如果內(nèi)參actin跑不好，其他目的蛋白想跑出漂亮條帶的難度也會(huì)大大增加，就好比地基沒(méi)打好，很難建成高樓。今天小優(yōu)細(xì)節(jié)君就來(lái)幫大家分析下為什么actin會(huì)有多條帶？

蛋白特性
Western實(shí)驗(yàn)最重要的兩個(gè)因素，一是蛋白，二是抗體。要探究原因，必須從源頭出發(fā)，我們先看看蛋白特性。
研究發(fā)現(xiàn)，有很多蛋白酶可以降解actin，使原本42KDa的actin變成更短的片段,40-41KDa、37KDa、30-32KDa、10-15KDa等。

圖1是凝血酶Thrombin作用不同時(shí)間后G-actin和F-actin的降解情況，主要生成37KDa(K),27KDa(L)和10KDa(M)條帶。

圖1

圖2是組織蛋白酶Cathepsin L作用不同時(shí)間后actin的降解情況，先生成40KDa和30KDa的條帶，隨著時(shí)間增加，又出現(xiàn)了37KDa的條帶。

圖2

圖3是彈性硬蛋白酶（PMN-Elastase）剪切actin的情況，生成了37KDa的條帶，剪切位點(diǎn)在Val43 and Met44之間。

圖3

圖4是白介1β轉(zhuǎn)化酶（ICE）作用不同時(shí)間后actin的降解情況，先生成了41KD的條帶，隨著時(shí)間增加，又出現(xiàn)了30KD和14KD的條帶。

圖4

圖5是半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)剪切actin的情況，和ICE酶類似，凋亡情況下，actin會(huì)被剪切，產(chǎn)生多條帶。而被 caspase-3 剪切的actin，會(huì)被泛素/蛋白酶體加速降解。

圖5

還有許多尚未發(fā)現(xiàn)的酶都有可能對(duì)actin有剪切和降解作用，看到這里，有小伙伴會(huì)問(wèn)，我做的課題又沒(méi)加這些酶，為什么還是會(huì)有多條帶呢？

其實(shí)不然，像上面提及的凝血酶、組織蛋白酶等是本身存在且廣泛分布的，在提取蛋白的過(guò)程中就會(huì)將它們釋放出來(lái)，成為降解actin的“兇手”。為什么我們一直強(qiáng)調(diào)制樣要加入蛋白酶抑制劑，以及冰上操作，就是為了抑制這些酶的活性。

那是不是加了蛋白酶抑制劑就萬(wàn)事大吉了呢？
研究發(fā)現(xiàn)，即使添加了多種蛋白酶抑制劑，包括桿菌肽(bacitracin),亮肽素(leupeptin),抑肽素(pepstatin),抗蛋白酶(antipain),苯甲基磺酰氟(PMSF)等，還是無(wú)法抑制凋亡對(duì)內(nèi)參的降解(圖6)。所以，我們還要盡量保持細(xì)胞處于良好的狀態(tài)和較低的傳代次數(shù)，避免發(fā)生凋亡。而對(duì)于研究凋亡的小伙伴來(lái)說(shuō)，需要根據(jù)具體情況選擇合適的抗體或者考慮其他內(nèi)參。

圖6

抗體特性
這時(shí)又小伙伴又問(wèn)了，我按照要求制樣之后還有多條帶，怎么辦呢？
前面我們提到了Western的兩大影響因素，除了蛋白本身，我們還可以從抗體入手，工欲善其事，必先利其器。Actin最常見(jiàn)的剪切片段是37 kDa，是因?yàn)樵S多酶都會(huì)在N端進(jìn)行剪切，大概在Val43，或者更靠近N端的位點(diǎn)。這時(shí)我們可以在選擇抗體的時(shí)候花一點(diǎn)“小心思”，盡量選擇免疫原在N端，并且比剪切位點(diǎn)更靠近N端的抗體，就可以盡量“避免”識(shí)別剪切下來(lái)的片段，從而獲得單一條帶。這里需要注意，此時(shí)我們獲得的Western結(jié)果雖然是單一條帶，但不能反映樣本本身是否降解或剪切。如果剪切位點(diǎn)在靠近C端的位置，抗體也會(huì)識(shí)別大片段。
還有一點(diǎn)需要注意，actin的N端序列在物種間的保守程度不如C端，因此這類抗體識(shí)別的種屬范圍不如其他C端抗體或者多克隆抗體廣，但特異性較高。

總結(jié)一下，如果你在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)actin的條帶總是出現(xiàn)其他固定位置的條帶，比如37kDa、30 kDa等，很有可能就是酶的作用使actin發(fā)生了剪切。建議使用新鮮的組織或者健康的細(xì)胞進(jìn)行重新制樣，制樣過(guò)程中充分抑制蛋白酶活性。選擇抗體盡量選擇N端單克隆抗體，可以事半功倍。希望大家都能做出完美的actin單一條帶~

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