利用熒光壽命光片顯微鏡進(jìn)行活體功能成像

瀏覽次數(shù)：174　發(fā)布日期：2026-3-3　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

光片顯微鏡已成為生物樣品快速、低光毒性體積成像不可或缺的工具，主要以標(biāo)準(zhǔn)格式提供結(jié)構(gòu)或分析物濃度數(shù)據(jù)。熒光壽命成像顯微鏡(FLIM)提供功能性對比度，但獲取速度往往有限，且實(shí)施復(fù)雜。因此，我們將專用的頻域CMOS FLIM相機(jī)和強(qiáng)度調(diào)制激光器集成到光片設(shè)置中，以增加熒光壽命成像功能，從而能夠快速采集具有濃度獨(dú)立對比度的體積數(shù)據(jù)。然后我們應(yīng)用該系統(tǒng)對活體轉(zhuǎn)基因斑馬魚進(jìn)行成像，展示了從體內(nèi)樣本快速收集體積FLIM 數(shù)據(jù)的能力。

生物學(xué)中的許多重要懸而未決的問題都需要在體內(nèi)以高時(shí)空分辨率對分子動力學(xué)進(jìn)行成像。光片顯微，在過去十鏡，或選擇性平面照明顯微鏡(SPIM)年中發(fā)展成為快速、低光漂白成像許多不同生物樣品的首選方法，特別是在體內(nèi)。

熒光終生成像顯微鏡(FLIM)是細(xì)胞生物學(xué)中實(shí)現(xiàn)濃度獨(dú)立性的重要方法。特別是，使用時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)(TCSPC)技術(shù)的時(shí)域FLIM是使用FRET方法測量分子動態(tài)相互作用的金標(biāo)準(zhǔn)。
然而，測量壽命的精確度取決于數(shù)量，因此 TCSPC-FLIM 本質(zhì)上是一個(gè)緩慢的過程，即使在多個(gè)處理器上多路復(fù)用時(shí)也是如此。這與在體內(nèi)平行快速運(yùn)動的細(xì)胞(如癌癥或免疫細(xì)胞)中測量壽命信號的需要是不相容的。

頻域(FD)-FLIM 可以比傳統(tǒng)光子計(jì)數(shù)方法提高采集速度，但由于應(yīng)用了調(diào)制頻率，其壽命精度受到限制。然而，如果已知樣品的預(yù)期壽命并適當(dāng)匹配調(diào)制頻率，F(xiàn)D-FLIM 是與廣場顯微鏡集成的明智選擇。其中只有光片可以提供快速的光學(xué)切片圖像。我們將采用CMOS相機(jī)(pco.flim)和調(diào)制二極管激光器轉(zhuǎn)換成數(shù)字掃描光片顯微鏡(DSLM)設(shè)置。以這種方式，我們結(jié)合的速度DSLM的三維成像與從FD-FLIM獲得的功能信息。

在文中描述了以前在光片顯微鏡配置中實(shí)現(xiàn)熒光壽命成像的方法。分別成像MDCK囊腫和細(xì)胞球體。兩項(xiàng)研究都使用了旋轉(zhuǎn)透鏡產(chǎn)生的光片，并在其設(shè)置中結(jié)合了門控圖像增強(qiáng)器(GII)。

如圖所示，F(xiàn)L-DSLM系統(tǒng)的光學(xué)設(shè)計(jì)(A)一張示意圖和（B）照片。從(A)開始，激光被放大(L1=75毫米，L2=50毫米)并通過掃描系統(tǒng)(L3，L4=50毫米)，以創(chuàng)建光片(G1)并提供z運(yùn)動(G2，與PI-FOC耦合)。然后將光束放大4倍(L5=50毫米，L6=200毫米)并進(jìn)入光電管以照亮樣品。發(fā)射的熒光通過DO收集，帶通濾波(F1)去除任何散射的激發(fā)光，并使用管狀透鏡(TL=200毫米)聚焦到FLIM 相機(jī)上。

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