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ChIP-seq+WGBS等分析揭示植物REM轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建DNA甲基化譜的分子機(jī)制

瀏覽次數(shù)：298　發(fā)布日期：2026-1-20　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

近日，浙江大學(xué)/加州大學(xué)洛杉磯分校吳忠壽研究員為第一作者，加州大學(xué)洛杉磯分校Steven E. Jacobsen院士為通訊作者，在《Nature Cell Biology》（IF19.1/Q1）發(fā)表題為“REM transcription factors and GDE1 shape the DNA methylation landscape through the recruitment of RNA polymerase IV transcription complexes”的研究論文，揭示了植物生殖分生組織（REM）轉(zhuǎn)錄因子和GDE1蛋白在招募Pol Ⅳ復(fù)合體以產(chǎn)生siRNA和指導(dǎo)特定基因組位點(diǎn)DNA甲基化中的關(guān)鍵分子機(jī)制。

研究綜合運(yùn)用染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序（ChIP-seq）、全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）、小RNA測(cè)序（sRNA-seq）、IP-MS質(zhì)譜等分析，在擬南芥中首次鑒定出一條全新RNA介導(dǎo)DNA甲基化（RdDM）通路調(diào)控機(jī)制：生殖分生組織（REM）家族特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子（VDD、VAL、REM12、REM13）能夠與GDE1蛋白協(xié)作，通過(guò)識(shí)別基因組上特定DNA 的motif序列（CLSY3/CLSY4 motif 1），將植物特有的RNA聚合酶IV（Pol IV）轉(zhuǎn)錄復(fù)合體精準(zhǔn)招募到靶位點(diǎn)（雌性生殖組織中的siren位點(diǎn)）。Pol IV招募導(dǎo)致序列特異性24-nt siRNA產(chǎn)生，進(jìn)而通過(guò)經(jīng)典的RdDM通路建立特定區(qū)域DNA甲基化。本研究揭示了特異性轉(zhuǎn)錄因子與siRNA產(chǎn)生及DNA甲基化調(diào)控之間的直接關(guān)聯(lián)，為表觀遺傳模式的遺傳調(diào)控提供了新見(jiàn)解。

英文標(biāo)題：REM transcription factors and GDE1 shape the DNA methylation landscape through the recruitment of RNA polymerase IV transcription complexes
中文標(biāo)題：REM轉(zhuǎn)錄因子和GDE1通過(guò)招募RNA聚合酶IV轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，構(gòu)建DNA甲基化譜
發(fā)表時(shí)間：2025年6月27日
發(fā)表期刊：Nature Cell Biology
影響因子：IF19.1/Q1
技術(shù)平臺(tái)：ChIP-seq、WGBS、RNA-seq等
DOI:10.1038/s41556-025-01691-0

易小結(jié)
本研究鑒定出不同于“表觀遺傳模式主要基于染色質(zhì)特征（如H3K9甲基化）自我維持”的經(jīng)典模式，發(fā)現(xiàn)了序列特異性轉(zhuǎn)錄因子直接編碼DNA甲基化圖譜的新機(jī)制，為理解植物發(fā)育與環(huán)境應(yīng)答中表觀遺傳模式的時(shí)空特異性編程提供了關(guān)鍵線索。

該研究基于WGBS與ChIP-seq的聯(lián)合分析，完整呈現(xiàn)“轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合→復(fù)合體招募→siRNA產(chǎn)生→DNA甲基化建立”因果圖譜，為跨物種表觀基因組學(xué)研究提供可參考的技術(shù)框架，并為作物雜交育種的甲基化模式提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。

易基因相關(guān)拓展性產(chǎn)品案例

研究方法
（1）植物材料和突變體構(gòu)建
轉(zhuǎn)基因植物構(gòu)建：Col-0擬南芥為對(duì)照，構(gòu)建帶有FLAG或Myc標(biāo)簽的十幾種蛋白過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。
突變體材料：

gde1-1（SALKseq_10069.1）：GDE1基因T-DNA插入缺失突變體
clsy3-1（SALK_040366）和clsy4-1（SALK_003876）：Pol IV招募因子雙突變體
rem46/val/rem12三突變體：通過(guò)CRISPR-Cas9系統(tǒng)同時(shí)敲除三個(gè)串聯(lián)重復(fù)的REM基因（REM46、VAL、REM12），產(chǎn)生部分功能喪失
rem8-cr：REM8基因CRISPR敲除突變體

（2）蛋白互作與定位分析

免疫沉淀-質(zhì)譜(IP-MS)：鑒定GDE1或VDD的互作蛋白。
蛋白質(zhì)印跡與Co-IP：驗(yàn)證IP-MS結(jié)果，并更靈敏檢測(cè)復(fù)合體組分間的互作。

（3）多組學(xué)綜合分析

ChIP-seq：約2g花組織，對(duì)GDE1-3FLAG、CLSY3-9myc、CLSY4-9myc、Pol IV-9myc、VDD/VAL/REM13/REM19/REM22/REM8-9myc、VDD-3FLAG等12種蛋白標(biāo)簽抗體進(jìn)行ChIP-seq，繪制全基因組蛋白結(jié)合圖譜。
WGBS：計(jì)算各序列背景下（CG, CHG, CHH）的C/(C+T)比率，獲得全基因組甲基化水平。直接量化gde1-1和clsy3clsy4突變體中Siren位點(diǎn)的CHG和CHH甲基化喪失，從功能層面證實(shí)REM-GDE1-CLSY3/4通路對(duì)非CG甲基化的依賴(lài)性。
小RNA測(cè)序(sRNA-seq)：胚珠組織或花藥樣本，鑒定各突變體中的siRNA位點(diǎn)。
DNA親和純化測(cè)序(DAP-seq)：野生型花蕾樣本，驗(yàn)證體外直接結(jié)合能力和序列特異性。

結(jié)果圖形
（1）GDE1編碼一個(gè)位于RdDM位點(diǎn)的未表征蛋白
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)IP-MS篩選與RdDM通路相關(guān)蛋白MORC7互作的未知蛋白，鑒定并命名新蛋白為GDE1 (GENETICS DETERMINES EPIGENETICS 1)。利用ChIP-seq技術(shù)分析其在花組織的基因組結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)GDE1與RdDM通路的多個(gè)核心組分中強(qiáng)共定位（圖1a-c）。motif（基序）富集分析顯示，GDE1的結(jié)合peak中存在一個(gè)保守DNA基序，該基序與之前報(bào)道的CLSY3偏好基序一致，且GDE1表達(dá)模式也與主要在花組織中表達(dá)的CLSY3/4高度相似（圖1d-f）。上述結(jié)果共同確立GDE1為RdDM通路中一個(gè)未知的、與CLSY3/4協(xié)同作用的核定位蛋白，其結(jié)合位點(diǎn)具有序列特異性。

圖1：GDE1是一個(gè)RdDM蛋白，并與Pol IV招募因子CLSY3/4共定位。
a-b. Meta圖和熱圖顯示GDE1的ChIP-seq信號(hào)在Pol IV（n=5,077）（a）和Pol V（n=16,327）（b）結(jié)合位點(diǎn)上的富集情況。
c. MORC7、Pol IV、Pol V和GDE1 ChIP-seq在代表性位點(diǎn)的截圖。
d. TomTom分析顯示CLSY3與GDE1結(jié)合motif的相似性。
e-f. Meta圖和熱圖顯示GDE1的ChIP-seq信號(hào)在CLSY3（n=380）（e）和CLSY4（n=1,368）（f）結(jié)合位點(diǎn)上的富集情況。

（2）GDE1指導(dǎo)CLSY3/4-Pol IV復(fù)合體調(diào)控siRNA產(chǎn)生
研究團(tuán)隊(duì)首先在胚珠組織中鑒定了753個(gè)CLSY3/4依賴(lài)的siRNA位點(diǎn)，且在clsy3clsy4雙突變體中表達(dá)下調(diào)。為驗(yàn)證GDE1是否影響siRNA產(chǎn)生，研究團(tuán)隊(duì)在gde1-1突變體胚珠組織中進(jìn)行了sRNA-seq。研究將依賴(lài)于CLSY3/4的siRNA位點(diǎn)根據(jù)在gde1-1中變化分為三組：Group 1（57%，siRNA減少）、Group 2（35%，siRNA增加）和Group 3（8%，不變）（圖2a-c）。
關(guān)鍵的發(fā)現(xiàn)是，CLSY3/4和Pol IV的ChIP-seq信號(hào)在Group 1位點(diǎn)（常染色質(zhì)區(qū)域，siren位點(diǎn)）上，于gde1-1背景下顯著減弱；在Group 2位點(diǎn)（異染色質(zhì)區(qū)域）上，卻出現(xiàn)了增強(qiáng)（圖2d）。GDE1自身的ChIP-seq信號(hào)在Group 1位點(diǎn)最強(qiáng)，Group 2位點(diǎn)最弱（圖2e）。功能回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，GDE1-3FLAG轉(zhuǎn)基因可完全恢復(fù)Group 1位點(diǎn)的siRNA水平（圖2b-c），證實(shí)表型特異性。上述結(jié)果說(shuō)明GDE1優(yōu)先調(diào)控常染色質(zhì)區(qū)的siRNA產(chǎn)生，并與異染色質(zhì)區(qū)Pol IV招募存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。

圖2：GDE1定位于CLSY3/CLSY4依賴(lài)性siRNA位點(diǎn)子集以促進(jìn)siRNA產(chǎn)生，而GDE1缺失會(huì)將CLSY3/4–Pol IV復(fù)合體重定位至其他位點(diǎn)。

餅圖顯示三組CLSY3/CLSY4依賴(lài)性siRNA位點(diǎn)的百分比分布。

b-c. 小提琴圖和熱圖分別顯示CLSY3/CLSY4依賴(lài)性位點(diǎn)中Group 1 (b) (n=429) 和Group 2 (c) (n=262) 的24-nt siRNA水平。
d. Meta圖顯示在野生型(WT)和gde1-1背景下，CLSY3/4和Pol IV的ChIP-seq信號(hào)在三組CLSY3/CLSY4依賴(lài)性位點(diǎn)上的富集情況。
e. Meta圖展示了GDE1的ChIP-seq信號(hào)在三組CLSY3/CLSY4依賴(lài)性位點(diǎn)上的富集情況。
f. 圈圖顯示Group 1和2中CLSY3/CLSY4依賴(lài)性siRNA在所有五條染色體上的富集分布。

（3）GDE1與REM家族轉(zhuǎn)錄因子共定位
為探究GDE1如何發(fā)揮作用，研究人員對(duì)GDE1-3FLAG進(jìn)行IP-MS分析，意外發(fā)現(xiàn)未富集到CLSY3/4-Pol IV組分，反而鑒定出多個(gè)REM轉(zhuǎn)錄因子家族成員（VDD、VAL、REM46等）（圖3a）。隨后，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)VDD、VAL、REM19、REM22、REM8進(jìn)行9myc標(biāo)簽ChIP-seq分析證實(shí)，四個(gè)REM轉(zhuǎn)錄因子（VDD, VAL, REM12, REM13）在Group 1位點(diǎn)存在顯著且相似的富集（圖3b-e、g），而另一些REM因子（如REM8）主要富集于Group 2位點(diǎn)（圖3b-d、h）。進(jìn)一步的IP-MS實(shí)驗(yàn)從VDD下拉獲得了GDE1、CLSY3、Pol IV組分，證實(shí)了在體內(nèi)存在由這些因子形成的復(fù)合體（圖3f）。這些結(jié)果表明，REM家族轉(zhuǎn)錄因子（VDD/VAL/REM12/REM13/REM19為主，REM8/REM22為輔）與GDE1協(xié)同作用，負(fù)責(zé)識(shí)別特定DNA序列并與CLSY3/4-Pol IV復(fù)合體結(jié)合。

圖3：REM轉(zhuǎn)錄因子在CLSY3/CLSY4依賴(lài)性siRNA位點(diǎn)與GDE1及Pol IV復(fù)合體結(jié)合

（4）GDE1在Siren位點(diǎn)調(diào)控siRNA產(chǎn)生與DNA甲基化
胚珠組織中主要的siRNA在Siren位點(diǎn)，86%的Siren位點(diǎn)含有CLSY3CLSY4 motif 1。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)VDD/VAL/REM13等REM轉(zhuǎn)錄因子和GDE1、CLSY3/4、Pol IV在該位點(diǎn)的ChIP-seq信號(hào)顯著富集（圖4a-b）。具體而言，在gde1-1突變體的胚珠組織中，siren位點(diǎn)的24-nt siRNA水平急劇下降，表型與clsy3clsy4雙突變體相似。

研究人員應(yīng)用WGBS分析了其DNA甲基化水平的變化，發(fā)現(xiàn)由于siRNA缺失，Siren位點(diǎn)的CHH和CHG甲基化水平在gde1-1中顯著降低，模式與clsy3clsy4一致（圖4d），這直接將GDE1介導(dǎo)的上游招募事件與最終的表觀遺傳修飾（DNA甲基化）降低相關(guān)聯(lián)，完成了從“序列識(shí)別”到“甲基化缺失”的表型鏈驗(yàn)證。

ChIP-seq比較揭示，gde1-1中CLSY3/4和Pol IV在Siren位點(diǎn)的占用丟失，但在非Siren位點(diǎn)無(wú)變化，說(shuō)明GDE1特異性穩(wěn)定Pol IV復(fù)合體于Siren位點(diǎn)。

圖4：VDD/VAL/REM13–GDE1–CLSY3/4復(fù)合體定位于siren位點(diǎn)以產(chǎn)生siRNA。

（5）REM轉(zhuǎn)錄因子正向調(diào)控siRNA產(chǎn)生
為直接驗(yàn)證REM轉(zhuǎn)錄因子的功能，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了vdd單突變以及rem46/val/rem12三突變體。sRNA-seq分析顯示，三突變體胚珠組織中Siren位點(diǎn)siRNA顯著下調(diào)（圖4e-f），與clsy3 clsy4雙突變的表型在Group 1有相當(dāng)程度的重合（圖4g），表明GDE1依賴(lài)REM轉(zhuǎn)錄因子以介導(dǎo)siRNA產(chǎn)生。

（6）RBHG結(jié)構(gòu)域在GDE1功能中至關(guān)重要
通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)GDE1的一個(gè)α螺旋區(qū)域（包含保守的RBHG基序）被預(yù)測(cè)與REM轉(zhuǎn)錄因子形成廣泛的氫鍵和π鍵相互作用（圖5a-c）。為驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)，研究團(tuán)隊(duì)將此區(qū)域內(nèi)三個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)（E251A/Y252A/Y255A）突變后進(jìn)行轉(zhuǎn)基因功能回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，雖然該突變體GDE1表達(dá)正常，但無(wú)法完全挽救gde1-1突變體中siren位點(diǎn)的siRNA缺失表型（圖5d），Siren位點(diǎn)siRNA恢復(fù)程度顯著低于野生型GDE1。上述結(jié)果表明該α螺旋結(jié)構(gòu)域?qū)τ贕DE1與REM轉(zhuǎn)錄因子的互作及其功能不可或缺，為復(fù)合體組裝提供了分子層面的結(jié)構(gòu)證據(jù)。

圖5：GDE1的RBHG結(jié)構(gòu)域?qū)iRNA產(chǎn)生至關(guān)重要

（7）REM-GDE1介導(dǎo)CLSY3/4-Pol IV復(fù)合體的單向轉(zhuǎn)錄
對(duì)motif分析發(fā)現(xiàn)，CLSY3/4 motif 1由2-3個(gè)重復(fù)的TTTTGCTTAT序列組成�；蚪M中具有這種結(jié)構(gòu)并產(chǎn)生顯著ChIP信號(hào)的位點(diǎn)很少（二重復(fù)約48個(gè)，三重復(fù)約38個(gè)）。ChIP-seq分析顯示，所有復(fù)合體組分都在這些位點(diǎn)富集，且REM-GDE1的peak中心位于基序中心，而CLSY3/4和Pol IV的峰則偏離中心約200-300 bp，且僅位于基序某一側(cè)（圖6a、c）。這表明REM-GDE1結(jié)合在DNA基序中心，然后招募CLSY3/4-Pol IV復(fù)合體，Pol IV隨后將從基序一側(cè)或另一側(cè)起始單向轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生pre-siRNA（圖6d）。DAP-seq實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在體外驗(yàn)證VDD-VAL-GDE1復(fù)合體只結(jié)合單堿基間隔的基序（圖6b）。

圖6：Pol IV轉(zhuǎn)錄復(fù)合體識(shí)別CLSY3/4 motif 1并進(jìn)行單向轉(zhuǎn)錄

（8）REM8識(shí)別CLSY3/4 Motif 2以在GDE1缺失時(shí)介導(dǎo)siRNA產(chǎn)生
此前結(jié)果顯示Group 2位點(diǎn)在gde1-1中siRNA上調(diào)。研究團(tuán)隊(duì)聚焦在Group 2富集的REM8，發(fā)現(xiàn)其不結(jié)合CLSY3/4 motif 1，而是識(shí)別AAGCGGAT三重復(fù)序列（命名為CLSY3/4 motif 2）（圖7b）。在gde1-1中，REM8結(jié)合的非Siren區(qū)域siRNA水平升高，且CLSY3/4和Pol IV占用增強(qiáng)（圖7a），表明GDE1缺失釋放的Pol IV復(fù)合體被REM8重定位至Group 2位點(diǎn)。

此外，CLSY3/4 motif 2位點(diǎn)的siRNA在clsy3clsy4中下降，在gde1-1中上升（圖7c），證實(shí)這些位點(diǎn)確實(shí)受CLSY3/4-Pol IV調(diào)控，但招募機(jī)制不同于Siren位點(diǎn)。這表明REM8（可能與其他未知因子一起）也介導(dǎo)了對(duì)另一類(lèi)DNA基序的識(shí)別和CLSY3/4-Pol IV的招募，是GDE1依賴(lài)路徑之外的另一種序列特異性招募機(jī)制。

值得注意的是，雖然雄性組織中大多數(shù)REM轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量很低，但GDE1表達(dá)卻非常高。在花藥組織中，約一半的CLSY3/4依賴(lài)性siRNA位點(diǎn)在gde1-1中也表現(xiàn)出類(lèi)似下調(diào)（圖7d-f）。上述發(fā)現(xiàn)揭示GDE1在胚珠組織中與REM因子協(xié)作，在花藥中可能與其他因子協(xié)作，實(shí)現(xiàn)組織特異性甲基化圖譜的精準(zhǔn)編程。

圖7：GDE1缺失條件下，REM8將Pol IV復(fù)合體重新定位至CLSY34 motif 2位點(diǎn)，且GDE1是花藥中siRNA產(chǎn)生必需

結(jié)論和啟示
本研究首次發(fā)現(xiàn)并闡明了一個(gè)由生殖特異性REM轉(zhuǎn)錄因子與GDE1蛋白協(xié)作，通過(guò)識(shí)別特定DNA基序，直接招募Pol IV轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，從而在特定基因組位點(diǎn)（如siren位點(diǎn)）啟動(dòng)siRNA產(chǎn)生和DNA甲基化的全新遺傳和表觀遺傳關(guān)聯(lián)通路。

ChIP-seq與WGBS在本研究中的重要作用
ChIP-seq通過(guò)對(duì)12種蛋白的精確定位，繪制了REM-GDE1-CLSY3/4-Pol IV的共定位網(wǎng)絡(luò)；通過(guò)比較野生型與突變體，揭示了復(fù)合體的動(dòng)態(tài)重定位；通過(guò)peak偏移分析，推斷單向轉(zhuǎn)錄模型。
WGBS在siRNA產(chǎn)生后，直接單堿基分辨率檢測(cè)DNA甲基化（CHG/CHH）修飾水平，從功能層面確認(rèn)該通路的生物學(xué)結(jié)果。
WGBS與ChIP-seq的聯(lián)合使用，使得從“蛋白定位”到“功能輸出”的因果鏈條完整閉合，是揭示新機(jī)制的黃金標(biāo)準(zhǔn)。

參考文獻(xiàn)：Wu Z, Xue Y, Wang S, Shih YH, Zhong Z, Feng S, Draper J, Lu A, Hoeke CA, Sha J, Li L, Wohlschlegel J, Wu K, Jacobsen SE. REM transcription factors and GDE1 shape the DNA methylation landscape through the recruitment of RNA polymerase IV transcription complexes. Nat Cell Biol. 2025 Jun 27. doi: 10.1038/s41556-025-01691-0.

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