利用384孔格式的ELISPOT檢測(cè)法進(jìn)行腫瘤免疫監(jiān)測(cè)

摘要

全面的免疫監(jiān)測(cè)需要測(cè)量產(chǎn)生不同細(xì)胞因子的T細(xì)胞頻率，以確定細(xì)胞介導(dǎo)免疫中Th1、Th2和Th17成分的強(qiáng)度�？乖�滴度檢測(cè)可提供關(guān)于T細(xì)胞反應(yīng)親和力的額外信息。在腫瘤免疫中，建議通過(guò)檢測(cè)多個(gè)表位來(lái)考慮決定簇?cái)U(kuò)散效應(yīng)。進(jìn)行全面免疫監(jiān)測(cè)需要大量 PBMC 系統(tǒng)運(yùn)行上述檢測(cè)，這在大多數(shù)檢測(cè)案例中是受限的。迄今為止，采用ELISPOT檢測(cè)法的免疫監(jiān)測(cè)已采用96孔板格式進(jìn)行。本研究顯示，通過(guò)在膜表面積僅為96孔板三分之一的384孔板中進(jìn)行檢測(cè)，可提高細(xì)胞利用率。對(duì)兩種格式中抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng) PBMC 的系統(tǒng)測(cè)試表明，384孔板檢測(cè)相當(dāng)于96孔板檢測(cè)的三分之一微型化。在384孔板格式中，允許與抗原呈遞細(xì)胞充分接觸的最低可用細(xì)胞數(shù)為33,000個(gè) PBMC /孔。因此，通常從1 mL血液中獲取的100萬(wàn)個(gè) PBMC ，可在384孔板格式中進(jìn)行30孔T細(xì)胞ELISPOT檢測(cè)。

1. 引言

T淋巴細(xì)胞是機(jī)體抵御癌癥及各類感染的主要防御細(xì)胞。監(jiān)測(cè)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)面臨兩大挑戰(zhàn)：其一，這些細(xì)胞分化為多種效應(yīng)細(xì)胞亞群，分泌不同且通�；コ獾男�應(yīng)分子；其二，只有全面評(píng)估所有亞群，才能揭示T細(xì)胞免疫的真實(shí)特性[1]。另一個(gè)挑戰(zhàn)在于，T細(xì)胞常同時(shí)靶向多種抗原/肽段，必須對(duì)所有抗原進(jìn)行檢測(cè)才能準(zhǔn)確評(píng)估免疫反應(yīng)強(qiáng)度�？乖�效價(jià)測(cè)定可反映T細(xì)胞反應(yīng)的親和力。因此，采用ELISPOT技術(shù)的全面免疫監(jiān)測(cè)需檢測(cè)多種分析物及測(cè)試條件。臨床試驗(yàn)方案通常要求同步進(jìn)行多項(xiàng)細(xì)胞檢測(cè)，這會(huì)增加額外的細(xì)胞損耗。理想情況下， PBMC 應(yīng)冷凍保存以供批量檢測(cè)，但這會(huì)導(dǎo)致更多細(xì)胞損失�；�于上述原因，受試者可獲取的細(xì)胞數(shù)量往往成為細(xì)胞免疫監(jiān)測(cè)的限制因素，尤其在涉及兒童、老年、免疫抑制或腫瘤受試者的試驗(yàn)中更為明顯。

目前尚無(wú)單一檢測(cè)方法能全面測(cè)量T細(xì)胞免疫的所有相關(guān)參數(shù)。ELISPOT檢測(cè)可揭示抗原反應(yīng)性Th1、Th2及Th17細(xì)胞的頻率與細(xì)胞因子特征。通過(guò)雙色ELISPOT檢測(cè)（酶聯(lián)或熒光法）測(cè)量IL-2與 IFN - γ 的共表達(dá)，可提供與流式細(xì)胞術(shù)同等靈敏度的多功能T細(xì)胞數(shù)量信息，但所需細(xì)胞數(shù)量更少[2]。在體外抗原暴露24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)到產(chǎn)生顆粒酶B（Granzyme B）和穿孔素（Perforin）的T細(xì)胞，表明CD8+效應(yīng)細(xì)胞近期在體內(nèi)被激活[3]。相反，若在體外抗原暴露24小時(shí)內(nèi)未檢測(cè)到產(chǎn)生顆粒酶B和穿孔素的T細(xì)胞，但在后續(xù)體外抗原刺激3-4天后檢測(cè)到這些細(xì)胞因子，則提示CD8+記憶細(xì)胞在體內(nèi)處于靜息狀態(tài)，但具有再激活后的細(xì)胞溶解潛能[4]。通過(guò)滴定測(cè)試抗原濃度可揭示T細(xì)胞對(duì)該抗原的親和力[5]，此類測(cè)量在腫瘤學(xué)及自身免疫試驗(yàn)中尤為重要。

在酶標(biāo)孔板檢測(cè)中，每個(gè)接種的細(xì)胞都會(huì)被逐一檢測(cè)。這種檢測(cè)方式進(jìn)一步提高了細(xì)胞利用率——細(xì)胞在檢測(cè)過(guò)程中不受影響地存活，可重復(fù)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[6,7]。然而， PBMC 數(shù)量常成為免疫監(jiān)測(cè)的瓶頸。為減少 PBMC 使用量，近期研究采用了一種新型酶標(biāo)孔板檢測(cè)法：先在384孔板和1536孔板中用抗原預(yù)激活細(xì)胞，再轉(zhuǎn)移至常規(guī)96孔酶標(biāo)孔板中測(cè)定細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)量[8]。由于此類細(xì)胞轉(zhuǎn)移操作易出錯(cuò)且耗時(shí)費(fèi)力，我們驗(yàn)證了是否可通過(guò)直接將 PBMC 接種于專用384孔酶標(biāo)孔板（其膜表面積 PVDF 常規(guī)96孔板）來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。需注意的是，這類384孔板的膜表面積僅為常規(guī)96孔板的三分之一（按孔數(shù)推算應(yīng)為四分之一）。鑒于酶標(biāo)孔板檢測(cè)依賴于單層T細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞（APC）接觸檢測(cè)，我們推測(cè)384孔板檢測(cè)所需的試劑（包括細(xì)胞材料）用量可精確控制在96孔板的三分之一。

2. 實(shí)驗(yàn)部分

2.1. 外周血單個(gè)核細(xì)胞

本研究使用的人源 PBMC 取自健康供體，這些供體選自Cellular Technology Ltd公司的參考數(shù)據(jù)庫(kù)[9]。所有供體均經(jīng)過(guò)HLA分型檢測(cè)，并預(yù)先表征了T細(xì)胞活性。細(xì)胞解凍采用優(yōu)化方案[10]：將冷凍管置于氮?dú)庹魵庵斜４�，隨后放入37°C玻璃珠浴槽中處理10分鐘（CTL -BB-001， CTL ，美國(guó)俄亥俄州克利夫蘭）。使用預(yù)熱至37°C的 CTL 抗聚集培養(yǎng)基（貨號(hào) CTL -AA-005， CTL ，美國(guó)俄亥俄州克利夫蘭）緩慢稀釋細(xì)胞。 PBMC 離心10分鐘后，棄去上清液，輕敲細(xì)胞沉淀使其重懸，再加入抗聚集培養(yǎng)基。使用 CTL 的活/死/凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)平臺(tái)（貨號(hào) CTL - LDAC -100）對(duì)細(xì)胞樣本進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)完成后再次離心，將細(xì)胞重懸于適量 CTL 檢測(cè)培養(yǎng)基（貨號(hào) CTLT -005， CTL ，美國(guó)俄亥俄州克利夫蘭），按實(shí)驗(yàn)要求接種相應(yīng)數(shù)量的人源 PBMC 。

2.2. 人 IFN - γ ELISPOT檢測(cè)

384孔和96孔的ELISPOT檢測(cè)均使用Cellular Technology Ltd.公司的人 IFN - γ 試劑盒（96孔試劑盒貨號(hào)hIFNG-1M/5,384孔試劑盒貨號(hào)hIFNG-3M/5）進(jìn)行。所有抗體、三抗、稀釋液和底物均包含在試劑盒中。兩種類型的板均按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。簡(jiǎn)言之，板在過(guò)夜后用人 IFN - γ 包被抗體進(jìn)行包被。次日，用PBS洗滌板一次，然后將HCMVpp65抗原（貨號(hào)CEF32-07-005）接種于 CTL -Test培養(yǎng)基中。96孔板接種 PBMC 后需100 µL ，384孔板需33 µL ，隨后將板置于37°C、7%二氧化碳的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中。孵育24小時(shí)后，移除 PBMC ，并加入試劑盒中的檢測(cè)抗體和顯色試劑。完成ELISPOT檢測(cè)后，將板置于層流罩中風(fēng)干，再進(jìn)行分析。

使用免疫斑點(diǎn)®S6Ultimate閱讀器（型號(hào)S6ULT9000， CTL ，美國(guó)俄亥俄州克利夫蘭）對(duì)酶標(biāo)儀斑點(diǎn)板進(jìn)行掃描分析。免疫斑點(diǎn)®軟件通過(guò)SmartCount™和Autogate™功能，自動(dòng)計(jì)算每種抗原刺激條件及陰性對(duì)照培養(yǎng)基中的斑點(diǎn)形成單位（SFU）[11]。

2.3. PBMC 的熒光檢測(cè)

PBMC 采用CalceinAM（貨號(hào)C3100MP，Invitrogen公司，美國(guó)加利福尼亞州卡爾斯巴德）進(jìn)行染色，具體操作為將1.0×10⁶ PBMC /mL的細(xì)胞懸液與含1 µL 1mMCalceinAM染料的DMSO（Sigma公司，美國(guó)密蘇里州圣路易斯）在 CTL -Test培養(yǎng)基中孵育。孵育結(jié)束后，離心10分鐘并棄去上清液，隨后用 CTL -Test培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，最終用于實(shí)驗(yàn)。

熒光檢測(cè)使用ImmunoSpot®S6UltimateReader（型號(hào)S6ULT9000， CTL ，美國(guó)俄亥俄州克利夫蘭）完成，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為480nm，檢測(cè)波長(zhǎng)采用520±20nm發(fā)射濾光片。

3. 結(jié)果與討論

3.1. CD8+細(xì)胞來(lái)源的 IFN - γ ELISPOT檢測(cè)顯示96孔板與384孔板中細(xì)胞大小分布一致

采用CEF肽段池刺激 PBMC 中的CD8+細(xì)胞，分別在96孔板和384孔板中平行進(jìn)行人 IFN - γ 斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)。由于384孔板的膜表面積僅為96孔板的三分之一，因此在384孔板中使用的 PBMC 數(shù)量及所有其他實(shí)驗(yàn)試劑均減少三分之一。圖1A、B展示了96孔板和384孔板的代表性孔板圖像。肉眼觀察顯示斑點(diǎn)大小和密度相似，但為更嚴(yán)格比較兩種孔板的斑點(diǎn)尺寸，進(jìn)行了圖像分析。96孔板和384孔板的圖像采用相同光學(xué)分辨率和數(shù)字分辨率采集，確�？蛇M(jìn)行相似比較。兩種孔板的斑點(diǎn)尺寸分析均顯示為鐘形曲線，且均值和離散度相同（圖1C、D）。以對(duì)數(shù)尺度計(jì)算，96孔板和384孔板的平均斑點(diǎn)尺寸分別為−2.575和−2.514，標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.482和0.411。因此，兩種孔板的斑點(diǎn)尺寸等效，證明單個(gè)細(xì)胞的T細(xì)胞分泌活性不受孔板尺寸影響。

圖1。

96孔板與384孔板中 IFN γ 的斑點(diǎn)尺寸及分布完全一致。（A，B）分別以相同光學(xué)分辨率和數(shù)字分辨率拍攝96孔板與384孔板的對(duì)應(yīng)圖像；（C，D）將兩孔的斑點(diǎn)尺寸以直方圖形式呈現(xiàn)，并疊加紅色擬合對(duì)數(shù)正態(tài)曲線。

384孔板中的斑點(diǎn)尺寸分布與正態(tài)（高斯）函數(shù)的鐘形曲線高度吻合（圖1C、D）。為統(tǒng)計(jì)學(xué)驗(yàn)證曲線是否符合正態(tài)分布，我們采用柯爾莫哥洛夫-斯米爾諾夫擬合優(yōu)度檢驗(yàn)進(jìn)行分析，設(shè)定顯著性水平 α =0.05。96孔板與384孔板的斑點(diǎn)尺寸p值分別為0.419和0.220。由于兩個(gè)p值均大于0.05的顯著性閾值，因此可判定斑點(diǎn)尺寸分布符合正態(tài)分布。

建立正常的斑點(diǎn)大小分布至關(guān)重要，因?yàn)檫@允許進(jìn)行客觀計(jì)數(shù)。對(duì)于96孔板格式[12]以及384孔板，可通過(guò)將最小和最大斑點(diǎn)大小閾值設(shè)置為平均斑點(diǎn)大小的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差（SD）來(lái)實(shí)現(xiàn)基于統(tǒng)計(jì)學(xué)的自動(dòng)化大小門控。當(dāng)斑點(diǎn)大小呈正態(tài)分布時(shí)，大于平均值3個(gè)SD的斑點(diǎn)（具有超過(guò)99.7%的置信度）源自細(xì)胞簇，需通過(guò)估算構(gòu)成該簇的斑點(diǎn)數(shù)量（即分泌分析物的細(xì)胞）進(jìn)行計(jì)數(shù)。小于平均值3個(gè)SD的斑點(diǎn)（具有超過(guò)99.7%的確定性）代表檢測(cè)假象，必須通過(guò)門控排除�；�于這些門控規(guī)則，我們比較了兩種板格式獲得的斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。

3.2. 在384孔板和96孔板中，均觀察到 PBMC 數(shù)量與點(diǎn)形成單元（SFU）之間呈線性關(guān)系

在96孔板中，斑點(diǎn)數(shù)量與細(xì)胞數(shù)量之間的關(guān)系在每孔1.0×10⁵至1.0×10⁶個(gè) PBMC 范圍內(nèi)呈線性關(guān)系[13]，但超過(guò)或低于該細(xì)胞數(shù)量范圍時(shí)線性關(guān)系不再成立。為確保T細(xì)胞活化及隨之產(chǎn)生的細(xì)胞因子分泌，T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞（APC）必須在細(xì)胞膜上形成接觸。細(xì)胞數(shù)量與斑點(diǎn)計(jì)數(shù)的線性范圍表明：當(dāng)每孔接種少于1.0×10⁵個(gè) PBMC 時(shí)，細(xì)胞間接觸無(wú)法實(shí)現(xiàn)；而當(dāng)接種量超過(guò)1.0×10⁶個(gè)時(shí)，細(xì)胞開始出現(xiàn)擁擠現(xiàn)象。在這兩個(gè)極端值之間， PBMC 應(yīng)能在細(xì)胞膜上形成單層結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)每個(gè)抗原特異性T細(xì)胞的活化與檢測(cè)。為驗(yàn)證該假說(shuō)，我們采用熒光染料對(duì) PBMC 進(jìn)行染色，并以十倍梯度稀釋法將其接種至96孔板中。如圖2所示，當(dāng)每孔接種1.0×10⁴個(gè) PBMC 時(shí)，細(xì)胞分布過(guò)于分散，無(wú)法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間接觸；當(dāng)接種量為1.0×10⁵個(gè)時(shí)， PBMC 接近形成細(xì)胞間接觸的臨界密度；而當(dāng)接種量達(dá)到1.0×10⁶個(gè)時(shí)，細(xì)胞開始出現(xiàn)過(guò)度擁擠，不再維持單層結(jié)構(gòu)。因此，96孔板格式下細(xì)胞數(shù)量/斑點(diǎn)計(jì)數(shù)的線性數(shù)據(jù)與單層假說(shuō)相符。

圖2。

PBMC 經(jīng)熒光CalceinAM染料染色后，將指定數(shù)量的細(xì)胞接種至96孔板相應(yīng)孔中。使用480nm激發(fā)波長(zhǎng)的ImmunoSpot®S6UltimateReader讀板儀進(jìn)行細(xì)胞成像，并通過(guò)520±20nm發(fā)射波長(zhǎng)濾光片檢測(cè)熒光信號(hào)。

若單層假說(shuō)成立，那么將 PBMC 以相同細(xì)胞密度接種至384孔板（即膜孔數(shù)為膜孔數(shù)三分之一）時(shí)，同樣會(huì)呈現(xiàn)斑點(diǎn)數(shù)與細(xì)胞數(shù)的線性關(guān)系，盡管每孔的斑點(diǎn)數(shù)僅為膜孔數(shù)的三分之一。

為探究384孔板中細(xì)胞數(shù)量/斑點(diǎn)計(jì)數(shù)的線性關(guān)系，將 PBMC 調(diào)整至1.5×10⁷個(gè)/mL，并進(jìn)行12級(jí)梯度稀釋。將細(xì)胞平行接種于96孔板和384孔板中，分別用移液器將細(xì)胞懸液 100μL 至96孔板和33 μL 至384孔板。隨后采用 HCMV pp65抗原刺激CD8+細(xì)胞，進(jìn)行人 IFN - γ 斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖3所示：96孔板中，每孔1.0×10⁵個(gè)細(xì)胞與1×10⁶個(gè)細(xì)胞之間呈現(xiàn)近乎完美的線性關(guān)系（R²=0.9782）；384孔板中，當(dāng)接種量為上述數(shù)值的三分之一時(shí)，每孔3.3×10⁴個(gè) PBMC 與3.5×10⁵個(gè)細(xì)胞之間也呈現(xiàn)近乎完美線性（R²=0.9823）。兩種孔板格式中，當(dāng)細(xì)胞密度高于或低于上述數(shù)值時(shí)，斑點(diǎn)計(jì)數(shù)與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系開始偏離線性。

圖3。

 

（A，B）PBMC 以指定數(shù)量進(jìn)行連續(xù)稀釋后接種于酶標(biāo)儀檢測(cè)板，加入 HCMV pp65以誘導(dǎo)特異性CD8+細(xì)胞產(chǎn)生 IFN - γ 。向(B)384孔板添加的 PBMC 數(shù)量為(A)96孔板的三分之一。疊加的紅線顯示理想線性函數(shù)。對(duì)于96孔板，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在每孔1.0×10⁵個(gè)細(xì)胞至1×10⁶個(gè)細(xì)胞范圍內(nèi)近似符合線性關(guān)系（R²=0.9782）；對(duì)于384孔板，線性關(guān)系在每孔3.3×10⁴個(gè) PBMC 至3.5×10⁵個(gè)細(xì)胞范圍內(nèi)近似成立（R²=0.9823）。

3.3. 384孔板重復(fù)孔中的點(diǎn)計(jì)數(shù)服從正態(tài)分布

根據(jù)上述數(shù)據(jù)，當(dāng) PBMC 以相同密度接種時(shí)，384孔板的斑點(diǎn)計(jì)數(shù)應(yīng)為96孔板的三分之一，即每孔絕對(duì)數(shù)值的三分之一。由于96孔板重復(fù)孔之間存在固有變異性（研究顯示其遵循正態(tài)分布[14]），要直接比較96孔與384孔板的差異，最佳方法是驗(yàn)證384孔板中重復(fù)孔的變異性是否遵循相同規(guī)律。此外，重復(fù)孔斑點(diǎn)計(jì)數(shù)的正態(tài)分布特性，使我們能夠通過(guò)參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法比較抗原誘導(dǎo)斑點(diǎn)計(jì)數(shù)與培養(yǎng)基對(duì)照孔的數(shù)值，從而確定陽(yáng)性反應(yīng)的判定閾值。

PBMC 在384孔板中進(jìn)行測(cè)試，每孔接種5×10⁴個(gè)細(xì)胞（384個(gè)重復(fù)孔）和1.0×10⁵個(gè)細(xì)胞（192個(gè)重復(fù)孔）。兩種情況下均使用 HCMV pp65刺激CD8+細(xì)胞。采用Shapiro Wilk檢驗(yàn)評(píng)估重復(fù)孔中的斑點(diǎn)計(jì)數(shù)是否符合正態(tài)分布。根據(jù)該檢驗(yàn)，兩種細(xì)胞稀釋度的p值分別為0.708和0.388（α =0.05）。由于p值大于顯著性水平（α），重復(fù)孔中的斑點(diǎn)數(shù)量被認(rèn)為符合正態(tài)分布。重復(fù)孔實(shí)驗(yàn)斑點(diǎn)計(jì)數(shù)的Q-Q圖（圖4）呈線性，證實(shí)了Shapiro Wilk檢驗(yàn)的結(jié)果。這證明384孔板重復(fù)孔中的斑點(diǎn)計(jì)數(shù)（如先前96孔板研究[14]所述）遵循正態(tài)分布函數(shù)。因此，在384孔板和96孔板檢測(cè)中，均可使用參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法（包括Student‘s檢驗(yàn)或方差分析）比較檢測(cè)結(jié)果。這也意味著無(wú)需采用經(jīng)驗(yàn)性截?cái)嘀担ɡ��?6孔板中>10個(gè)斑點(diǎn)）來(lái)判定陽(yáng)性與陰性反應(yīng)孔。既往研究中定義了“最小斑點(diǎn)數(shù)”以區(qū)分陽(yáng)性與陰性反應(yīng)，因?yàn)檫@些細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行參數(shù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，而參數(shù)檢驗(yàn)可明確區(qū)分二者。

圖4。

384孔板重復(fù)孔的點(diǎn)計(jì)數(shù)變異符合正態(tài)分布。 PBMC 接種于：(A)384個(gè)重復(fù)孔，每孔0.5×10⁵個(gè)細(xì)胞；(B)192個(gè)重復(fù)孔，每孔1.0×10⁵個(gè)細(xì)胞。采用 IFN - γ 斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測(cè) HCMV pp65抗原的反應(yīng)。通過(guò)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)（α 值0.05，p值分別為0.708和0.388）確認(rèn)數(shù)據(jù)正態(tài)性。實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)與理論計(jì)數(shù)的Q-Q圖如圖所示。

3.4. 384孔板中的 SFU 僅為96孔板的三分之一

我們采用平行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)12份不同冷凍保存的 PBMC 樣本進(jìn)行雙板格式檢測(cè)，其中11份樣本對(duì) HCMV pp65呈陽(yáng)性反應(yīng)。細(xì)胞以每孔3×10⁵ PBMC 的密度接種于96孔板（每個(gè)孔接種1.0×10⁵個(gè)細(xì)胞，每孔三復(fù)孔），并以三分之一體積（每孔1.0×10⁵個(gè)細(xì)胞）接種于384孔板（每個(gè)孔接種1.0×10⁵個(gè)細(xì)胞，每孔三復(fù)孔）。384孔板實(shí)驗(yàn)中，其余試劑用量均按96孔板的三分之一比例使用。所有檢測(cè)結(jié)果均通過(guò)包含384孔板計(jì)數(shù)功能的ImmunoSpot®軟件（版本5.3.6）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。如表1所示，11位陽(yáng)性供體的96孔板平均 SFU 數(shù)（每孔三個(gè)復(fù)孔）約為384孔板平均菌落形成單位（SFU）的三倍。當(dāng)計(jì)算11位供體的平均值（三復(fù)孔數(shù)據(jù)的平均值）時(shí)，所得結(jié)果呈現(xiàn)近乎完美的1:3比例關(guān)系。

表1。

96孔板格式的斑點(diǎn)計(jì)數(shù)約為384孔板格式的三倍。對(duì)于11名受試者，HCMVpp65誘導(dǎo)的反應(yīng)在每種板格式中均進(jìn)行三次重復(fù)孔測(cè)定，并顯示三次重復(fù)斑點(diǎn)計(jì)數(shù)的平均值。96孔板格式與384孔板格式的平均斑點(diǎn)計(jì)數(shù)比值顯示于右側(cè)列。

測(cè)試	96孔板	384孔	96W/384W
1	670.0	177.5	3.8
2	577.5	177.3	3.3
3	547.3	173.8	3.1
4	499.3	164.0	3.0
5	423.0	118.5	3.6
6	344.5	102.8	3.4
7	260.0	77.8	3.3
8	140.3	52.3	2.7
9	126.0	35.5	3.5
10	66.8	21.8	3.1
11	26.0	7.5	3.5
			平均值 3.3 ± 0.3

 

3.5. 96孔板與384孔板格式中觀察到匹配的劑量反應(yīng)曲線

為應(yīng)對(duì)可用測(cè)試樣本 PBMC 有限的問(wèn)題，免疫監(jiān)測(cè)工作主要依賴單次抗原劑量下的T細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)。然而，此類檢測(cè)無(wú)法獲取T細(xì)胞對(duì)抗原功能親和力的關(guān)鍵信息，而該信息可通過(guò)抗原系列稀釋檢測(cè)來(lái)確定[5]。鑒于384孔板格式可使細(xì)胞使用量降低三倍，將親和力檢測(cè)納入T細(xì)胞監(jiān)測(cè)檢測(cè)中應(yīng)成為可能。

我們測(cè)試了在96孔板和384孔板中進(jìn)行的T細(xì)胞功能親和力測(cè)量是否會(huì)產(chǎn)生相同的結(jié)果。將 PBMC 以每孔3×10^5個(gè)細(xì)胞的密度接種到96孔板中，以每孔1.0×10^5個(gè)細(xì)胞的密度接種到384孔板中。 HCMV pp65抗原的滴定范圍從10 µg /mL降至每孔1.0×10^-6 µg 。如圖5所示，兩種板型的劑量反應(yīng)曲線是平行的。曲線在96孔板中達(dá)到約360個(gè)斑點(diǎn)/孔，在384孔板中達(dá)到約105個(gè)斑點(diǎn)/孔。因此，96孔板中50%最大刺激的值為180個(gè)斑點(diǎn)/孔，384孔板中為53個(gè)斑點(diǎn)/孔。達(dá)到50%最大刺激的抗原濃度代表Keff50值，定義了親和力。兩種孔板格式的Keff50值幾乎相同，均為7.5ng/mL。數(shù)據(jù)顯示，384孔板檢測(cè)在測(cè)量T細(xì)胞功能親和力方面與96孔板檢測(cè)同樣有效，但僅需三分之一的細(xì)胞數(shù)量。

圖5。

在384孔和96孔板格式中進(jìn)行的T細(xì)胞功能親和力測(cè)量結(jié)果相同。通過(guò) PBMC 檢測(cè)了96孔和384孔板中CD8+細(xì)胞對(duì) HCMV 肽pp65誘導(dǎo)的 IFN - γ 產(chǎn)生。測(cè)試的最高肽濃度為10 μg/mL，隨后進(jìn)行1:10系列稀釋。96孔板中接種的 PBMC 數(shù)量為3×10^5/孔（綠線），384孔板中為1×10^5/孔（藍(lán)線）。最大激活50%的位置用紅色X標(biāo)記。

當(dāng)抗原進(jìn)行系列稀釋時(shí)，通常無(wú)需設(shè)置重復(fù)孔，因?yàn)檫B續(xù)抗原濃度的系列孔可確認(rèn)陽(yáng)性反應(yīng)。384孔板格式的功能親和力測(cè)定，所需 PBMC 量可與常規(guī)96孔板單次抗原劑量測(cè)定相同或更少。在常規(guī)96孔板檢測(cè)中，單次抗原劑量下以每孔3×10⁵ PBMC 進(jìn)行三重復(fù)孔抗原反應(yīng)性測(cè)試，需9×10⁵ PBMC 外加等量培養(yǎng)基對(duì)照 PBMC（即1.8×10⁶ PBMC）。而在對(duì)應(yīng)的384孔板格式中，細(xì)胞接種密度為每孔1.0×10⁵個(gè)；使用1.8×10⁶ PBMC 時(shí)，可額外設(shè)置15個(gè)孔用于劑量反應(yīng)曲線測(cè)試（其中3個(gè)孔分配給培養(yǎng)基對(duì)照），從而獲取關(guān)于T細(xì)胞反應(yīng)親和力的寶貴補(bǔ)充信息。

3.6. 384孔板檢測(cè)的信噪比性能較低

現(xiàn)有數(shù)據(jù)顯示，在384孔板格式的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)中， PBMC 和試劑每減少三分之一，抗原誘導(dǎo)的斑點(diǎn)計(jì)數(shù)（即信號(hào)強(qiáng)度）會(huì)按比例減少三分之一。由于酶聯(lián)斑點(diǎn)數(shù)據(jù)的解讀依賴于信噪比（培養(yǎng)基背景值），我們比較了兩種板格式的這一指標(biāo)。我們平行測(cè)試了三種不同冷凍保存的 PBMC 樣本，這些樣本先前已被確認(rèn)在兩種孔板格式中分別對(duì) HCMV pp65抗原產(chǎn)生高、中、低反應(yīng)。與先前結(jié)果一致，384孔板中抗原誘導(dǎo)的 SFU 數(shù)量是96孔板中 SFU 數(shù)量的三分之一（圖6）。然而，我們?cè)?6孔板和384孔板的中等對(duì)照孔中觀察到相似數(shù)量的 SFU ，該數(shù)量在三位供體中介于1至4個(gè)斑點(diǎn)之間。96孔板的信噪比平均比384孔板高2.8倍（分別為2.3倍、3.6倍和2.6倍）。在嘗試識(shí)別弱T細(xì)胞反應(yīng)時(shí)，必須考慮384孔板較低的信噪比性能。提高信噪比的一種方法是：對(duì)于弱反應(yīng)樣本，從 PBMC 群體中純化CD8細(xì)胞并使用純化的CD8細(xì)胞而非 PBMC 。CD8細(xì)胞可相互呈遞抗原，因此無(wú)需額外的非分泌性抗原呈遞細(xì)胞（APC）。通常情況下，CD8細(xì)胞約占 PBMC 的25%，因此當(dāng)接種細(xì)胞數(shù)量相同時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度可提升四倍。此外，由于實(shí)驗(yàn)中不存在旁觀細(xì)胞，背景干擾也會(huì)降低，從而進(jìn)一步提高信噪比。

圖6。

96孔板與384孔板的信噪比性能對(duì)比。圖中展示了 HCMV pp65抗原誘導(dǎo)反應(yīng)（斜線柱狀圖）及培養(yǎng)基對(duì)照（實(shí)心柱狀圖——多數(shù)因尺寸過(guò)小無(wú)法顯示）在三位供體高、中、低反應(yīng)水平下的表現(xiàn)。96孔板 PBMC 數(shù)為3×10⁵，384孔板為1.0×10⁵。各條件下三個(gè)重復(fù)孔的平均斑點(diǎn)計(jì)數(shù)/孔值標(biāo)注于柱狀圖上方。刺激指數(shù)（SI）定義為抗原誘導(dǎo)的ELISPOT數(shù)除以培養(yǎng)基背景中的斑點(diǎn)數(shù)。對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基對(duì)照/抗原配對(duì)的SI值已明確標(biāo)注。

3.7. 384孔板低點(diǎn)計(jì)數(shù)的變異系數(shù)高于96孔板對(duì)應(yīng)孔位

在酶標(biāo)免疫分析中，稀有抗原特異性T細(xì)胞會(huì)在大量旁觀細(xì)胞中被識(shí)別。因此，可以預(yù)期變異系數(shù)（CV：重復(fù)樣本間的孔間變異性）會(huì)隨著測(cè)試樣本中特異性T細(xì)胞數(shù)量的減少而增加。換言之，給定測(cè)試樣本中抗原特異性T細(xì)胞的頻率越低，該樣本體積在重復(fù)孔中移液時(shí)此類細(xì)胞的變異性就越高。同樣可以預(yù)測(cè)，在相同低濃度抗原特異性細(xì)胞條件下，當(dāng)樣本體積較小時(shí)，孔間變異性會(huì)更高。由于96孔板中接種了100 μL PBMC 樣本，而384孔板中接種了33 μL 相同濃度的 PBMC ，因此384孔板的CV應(yīng)更高。

為驗(yàn)證這些預(yù)測(cè)，我們采用人類 IFN - γ 斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)：用四種抗原刺激三名供體的 PBMC ，同時(shí)將 PBMC 按線性范圍連續(xù)稀釋以獲得廣泛的斑點(diǎn)計(jì)數(shù)分布。每個(gè)細(xì)胞樣本和抗原稀釋度均進(jìn)行四重復(fù)孔實(shí)驗(yàn)。圖7顯示，計(jì)算每個(gè)復(fù)孔的變異系數(shù)（CV）并繪制其與該復(fù)孔平均斑點(diǎn)數(shù)的關(guān)系曲線。兩種板型中， SFU 較少的孔位CV值均高于 SFU 較多的孔位。96孔板對(duì)應(yīng)孔位的CV值低于384孔板。在384孔板格式下檢測(cè)低頻抗原特異性T細(xì)胞樣本時(shí)，這一特性同樣需要納入考量。

圖7。

在檢測(cè)低頻T細(xì)胞時(shí)，384孔板中重復(fù)孔的斑點(diǎn)計(jì)數(shù)變異度高于96孔板。對(duì)三位供體的 PBMC 進(jìn)行連續(xù)稀釋檢測(cè)，每個(gè)供體和細(xì)胞稀釋度均設(shè)置四個(gè)重復(fù)孔，以評(píng)估抗原誘導(dǎo)的 IFN - γ 反應(yīng)。96孔板中 PBMC 以每孔1.0×10⁶至1.0×10⁵個(gè)細(xì)胞的連續(xù)稀釋度接種，384孔板中則以每孔3×10⁵和3×10⁴個(gè)細(xì)胞的稀釋度接種。將四個(gè)重復(fù)孔的變異系數(shù)（CV）與對(duì)應(yīng)檢測(cè)結(jié)果的平均斑點(diǎn)數(shù)進(jìn)行繪圖。

4. 結(jié)論

采用常規(guī)96孔板進(jìn)行的酶聯(lián)斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT）相比其他T細(xì)胞監(jiān)測(cè)技術(shù)，其細(xì)胞利用率已顯著提升。通過(guò)引入384孔板ELISPOT檢測(cè)，我們成功將所需 PBMC 數(shù)量減少三分之二，這與384孔板膜表面積減少三倍的特性相匹配。系統(tǒng)性對(duì)比兩種檢測(cè)方式發(fā)現(xiàn)：384孔板中抗原誘導(dǎo)的斑點(diǎn)計(jì)數(shù)（每孔 PBMC 數(shù)量?jī)H為常規(guī)的三分之一）僅為96孔板的三分之一。因此，384孔板可便捷檢測(cè)高頻和中頻抗原特異性T細(xì)胞。但針對(duì)低頻T細(xì)胞，由于鋪板 PBMC 減少，刺激指數(shù)降低和重復(fù)樣本間變異系數(shù)（CV）升高成為必然結(jié)果。在384孔板低頻檢測(cè)中，增加重復(fù)孔數(shù)可彌補(bǔ)分辨率不足。由于384孔板重復(fù)孔的ELISPOT計(jì)數(shù)服從正態(tài)分布，可采用學(xué)生t檢驗(yàn)和方差分析等參數(shù)檢驗(yàn)來(lái)識(shí)別陽(yáng)性反應(yīng)。這對(duì)弱反應(yīng)尤為重要，因?yàn)樵黾又貜?fù)孔數(shù)能以更高統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性區(qū)分弱反應(yīng)與陰性反應(yīng)。