高速SCMOS斜面顯微鏡在心肌細胞鈣動力學研究中的應用
（論文部分內(nèi)容摘抄）
斜面顯微鏡(OPM)是一種光片顯微鏡，它使用單個高數(shù)值孔徑顯微鏡目標物進行熒光激發(fā)和收集。本文介紹了OPM的相對收集效率的測量方法然后引入一個包含兩個sCMOS相機的OPM系統(tǒng)使單個分離的心肌細胞能夠以每秒667幀的960x200像素連續(xù)研究22秒，以每秒960x200像元連續(xù)研究30秒。960x200X20個體素，每秒25卷。在這兩種情況下，OPM能夠記錄在兩個光譜通道，使細胞內(nèi)鈣通過探針與肌膜和橫管網(wǎng)絡通過膜染料同時進行研究。OPM系統(tǒng)，然后被應用到確定自發(fā)鈣波的空間起源，并測量其起源點的細胞橫向小管結構。進一步的結果表明，OPM系統(tǒng)也可以用于研究鈣火花參數(shù)，取決于它們與橫向小管結構的關系。
圖為系統(tǒng)的實驗配置示出在樣品平面中放置一個熒光球(藍色)。球體中激發(fā)熒光的區(qū)域用綠色表示。球面像是在光學系統(tǒng)的像面上成像的。詳見正文。M鏡、直流二向色放大器、AOTF聲光可調(diào)濾光片、單模光纖、L-球面透鏡、C-圓柱透鏡、FP-前焦平面、BFP-后焦平面、0-顯微鏡物鏡、TL-顯微管透鏡、EM-發(fā)射濾光片。
Fluo-4和CMO的激發(fā)波長分別為488nm和561nm。在01的后孔處，每個波長對應的激發(fā)功率約為280 uW。該功率分布在覆蓋整個系統(tǒng)視場寬度的照明片上(氧氣限制為400um)，比sCMOS相機拍攝的234x49um的視場要大。
每個2-D采集包括每個sCMOS相機上的15,000幀960x200像素。相機集成時間被設置為1.46毫秒幀間時間為1.5毫秒，從而達到每秒667幀的同步采集率，總持續(xù)時間為22.5秒。這兩個圖像堆棧表示不同信道被同步獲取，然后使用從美國空軍1951年測試圖的圖像確定的校正參數(shù)共同登記。
圖2心肌細胞內(nèi)t管位置的識別。((a)單個分離心肌梗死心肌細胞的CMO圖像。紅色表示CMO的熒光強度，白色表示感興趣的肌膜區(qū)(ROI)。(B)圖A所示圖像的傅里葉變換。圖A中紅色交叉點位置是手動定位的高空間頻率，對應于t-管結構。圖B中紅色交點位置對應于t管結構。(C)和(D)分別為單側和雙側高斯空頻濾波器。(E)計算的歸-化t-小管調(diào)制圖M，-(F)計算的t-小管位置的二進制圖(A)、(E)和(F)中的標條代表10um。(B)、(C和(D)中的尺度條代表0.25um-1的空間頻率。
我們提出了OPM相對于在常規(guī)顯微鏡中直接檢測熒光信號的收集效率的測量，并表明在我們的設置中，OPM角度為35°時，其收集效率為21%。作為這種較低檢測效率的交換條件，OPM具有與所有光片顯微技術相關聯(lián)的優(yōu)點，即只有被成像的焦平面被照明，也就是說，沒有平面外的光漂或光毒，也沒有圖像處理或移動部件需要獲得光學切片圖像，使光學切片圖像能夠以成像攝像機的幀速率直接獲得。
通過新穎的OPM的使用，我們已經(jīng)能夠第一次定位的起源Ca2+波在3-D。我們對細胞進行雙重染色，使其起源于肌細胞的t管結構。在對少量HF細胞(n=5)的初步研究中，我們發(fā)現(xiàn)HF肌細胞中較大的波頻率不是來自異常的脫管區(qū)，而是來自保留t-管組織的區(qū)域�；鸹ㄒ脖话l(fā)現(xiàn)在高t-tubule組織的區(qū)域更頻繁，特別是在上皮層區(qū)�；鸹ǖ男螒B(tài)也因管旁區(qū)火花較大和較長的區(qū)域而不同。需要進一步的研究來證實這些結果在一個更大的細胞的規(guī)定。
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