BCA蛋白質(zhì)定量法的原理、特點(diǎn)及應(yīng)用

Keywords：BCA蛋白濃度測定試劑盒；BCA；蛋白定量；標(biāo)準(zhǔn)曲線；BCA Protein Concentration Assay Kit；Bicinchoninic Acid；Protein Assay；Standard Curve;

在蛋白質(zhì)功能研究的眾多方法中，BCA法以其高靈敏度、對(duì)去垢劑出色的耐受性及操作簡便等特點(diǎn)，成為實(shí)驗(yàn)室廣泛采用的經(jīng)典選擇，尤其適用于成分復(fù)雜的細(xì)胞或組織裂解液。鑒于此，IPHASE作為體外研究生物試劑引領(lǐng)者，開發(fā)、生產(chǎn)了BCA蛋白濃度測定試劑盒（BCA Protein Concentration Assay Kit），為客戶的生物試劑蛋白定量提供“一站式”服務(wù)。下文將帶您快速掌握BCA法的核心原理與IPHASE BCA蛋白濃度測定試劑盒標(biāo)準(zhǔn)化操作。

01 BCA 蛋白濃度測定原理
BCA 法是對(duì)經(jīng)典 Lowry 法的改進(jìn)，克服了后者步驟繁瑣、對(duì)干擾物敏感等局限性，具有操作簡便快捷、靈敏度高、線性范圍寬、抗干擾性能優(yōu)良、兼容性能好及經(jīng)濟(jì)實(shí)用等多種優(yōu)勢(shì)。

BCA（Bicinchoninic Acid，2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉）蛋白質(zhì)定量法是一種廣泛應(yīng)用的蛋白質(zhì)檢測方法，其原理基于蛋白質(zhì)的還原。蛋白質(zhì)在堿性條件下可將二價(jià)銅離子（Cu²⁺）還原為一價(jià)銅離子（Cu⁺），隨后一價(jià)銅離子進(jìn)一步與BCA試劑形成穩(wěn)定的紫色絡(luò)合物，且該絡(luò)合物在562 nm波長處具有最大吸光度，通過測量吸光度即可定量蛋白質(zhì)濃度。具體而言，反應(yīng)分為兩步：第一步，在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵、酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸殘基能夠還原Cu²⁺為Cu⁺。第二步，生成的Cu⁺與兩個(gè)BCA分子螯合，形成紫色的Cu⁺-BCA絡(luò)合物。該方法靈敏度高、操作簡便，且對(duì)某些去污劑具有較好的耐受性。

（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）

02 IPHASE BCA蛋白濃度測定試劑盒操作步驟
根據(jù)以上原理，IPHASE BCA蛋白濃度測定試劑盒（BCA Protein Concentration Assay Kit）采用改良型 BCA 法配方，并根據(jù)儀器不同，分別提供按照“酶標(biāo)儀”及“分光光度計(jì)”的操作流程，客戶可根據(jù)現(xiàn)有儀器按需購買、操作。具體操作步驟及數(shù)據(jù)分析如下：

（1）稀釋標(biāo)準(zhǔn)品
使用PBS稀釋液將2 mg/mL BSA標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋即得到如下濃度系列的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品：

（2）配制BCA工作液
將BCA試劑與Cu試劑按50:1的體積比充分混合，即得BCA工作液。

（3）準(zhǔn)備待測樣本
將您的未知蛋白樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋（建議在預(yù)實(shí)驗(yàn)中摸索最佳稀釋倍數(shù)，使測量值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線中部）。

（4）加樣
①酶標(biāo)儀法：準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和試驗(yàn)樣品各20 μL至96孔酶標(biāo)板中。推薦每個(gè)樣品設(shè)置2~3個(gè)復(fù)孔。每孔加入200 μL BCA工作液，加蓋封板膜，輕輕振蕩混勻。

②分光光度計(jì)法：準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和試驗(yàn)樣品各100 μL加至標(biāo)記好的5 mL離心管中。每管加入2 mL BCA工作液，混勻。

（5）孵育與檢測
①酶標(biāo)儀法：37℃恒溫孵育30min，冷卻至室溫后，在3~5min內(nèi)使用酶標(biāo)儀讀取562 nm波長下的吸光度值。

②分光光度計(jì)法: 37℃恒溫孵育30min，冷卻至室溫后，在3~5min內(nèi)轉(zhuǎn)移至比色皿中，使用分光光度計(jì)讀取562 nm波長下的吸光度值。

注：IPHASE BCA蛋白濃度測定試劑盒使用分光光度計(jì)法可進(jìn)行50 test；使用微孔法可進(jìn)行500 test.

03 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析
（1）推薦使用四參數(shù)模型進(jìn)行曲線擬合。
（2）將樣品的吸光值代入回歸方程，計(jì)算蛋白濃度。
（3）若樣品經(jīng)過稀釋，最終蛋白濃度需乘以稀釋倍數(shù)。
（4）若蛋白濃度超過檢測范圍（0.02~2 mg/mL），請(qǐng)稀釋樣品后重新測定。

總而言之，IPHASE BCA蛋白濃度測定試劑盒，其顯色穩(wěn)定性更強(qiáng)、線性范圍更寬、重復(fù)性更好，可廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、組織、細(xì)胞裂解液、純化蛋白等多種樣品的蛋白濃度定量測定，是蛋白研究道路上不可或缺的工具。