登革病毒抑制劑的發(fā)現(xiàn)及其抗病毒機(jī)制研究

▶ 發(fā)表時(shí)間：2025年11月29日

▶ 期刊：《MedComm 》(IF=10.7)

▶ 發(fā)表團(tuán)隊(duì)：南方醫(yī)科大學(xué)余林中課題組

▶ 文章標(biāo)題：Discovery ofa Novel Non-Nucleoside Inhibitor of RNA-Dependent RNA Polymerase Against Dengue Virus

▶ 核心內(nèi)容：

登革病毒（DENV）是全球分布最廣的蚊媒病毒之一，每年導(dǎo)致數(shù)億人感染，數(shù)萬例死亡，目前尚無特異性抗病毒藥物獲批。病毒編碼的RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）是病毒基因組復(fù)制的核心酶，因其在宿主細(xì)胞中無同源蛋白而成為理想的抗病毒靶點(diǎn)。近日，南方醫(yī)科大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)在《MedComm》發(fā)表論文，報(bào)道從中藥三七中分離的天然化合物12β-hydroxydammar-3-one-20(S)-O-β-D-glucopyranoside（PN-1），可特異性靶向RdRp并有效抑制病毒復(fù)制，為抗登革病毒藥物研發(fā)提供了新型先導(dǎo)化合物。

 

研究方法
研究團(tuán)隊(duì)首先采用表面等離子共振技術(shù)，對(duì)14種三七來源的達(dá)瑪烷型三萜皂苷進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)PN-1與DENV-2 RdRp的結(jié)合親和力最高，平衡解離常數(shù)KD 為1.42 nM。通過等溫滴定量熱法、細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)及藥物親和反應(yīng)靶點(diǎn)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)PN-1可直接與病毒非結(jié)構(gòu)蛋白5（NS5）的RdRp結(jié)構(gòu)域結(jié)合，且不影響其甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域功能。

 

研究結(jié)果
1.PN-1通過共價(jià)修飾調(diào)控抑制RdRp活性
液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析表明，PN-1通過其裂解片段共價(jià)修飾RdRp上的四個(gè)保守氨基酸殘基：Glu255、Met387、Glu479和Ala507。定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這些位點(diǎn)的突變顯著減弱PN-1與RdRp的結(jié)合能力(圖2.A-E)。
 

圖2. PN-1共價(jià)修飾到RdRp蛋白的LCMSMS譜圖

（A,C 體內(nèi)非修飾肽段，B.PN-1修飾到Glu255肽段二級(jí)譜圖, D. PN-1修飾到Ala507肽段二級(jí)譜圖，E.對(duì)四個(gè)位點(diǎn)突變后顯著減少PN-1與RdRp蛋白結(jié)合）

 

2.PN-1通過構(gòu)象調(diào)控抑制RdRp活性

HDX-MS氫氘交換質(zhì)譜分析顯示，PN-1處理后，RdRp在多個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域的氫氘交換速率發(fā)生顯著變化，尤其是在拇指結(jié)構(gòu)域（肽段485–501與501–505）的交換率降低，提示該區(qū)域構(gòu)象趨于穩(wěn)定或封閉（圖3）。色氨酸熒光光譜也觀察到PN-1引起RdRp內(nèi)源熒光猝滅，進(jìn)一步支持其誘導(dǎo)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的結(jié)論（圖2F）。這些構(gòu)象改變最終導(dǎo)致RdRp酶活抑制，其半抑制濃度為6.10 μM。

圖3. PN-1結(jié)合并調(diào)控RdRp構(gòu)象

 

3.PN-1在體外與體內(nèi)模型中表現(xiàn)廣譜抗病毒活性

PN-1在多種細(xì)胞系中均能顯著抑制DENV-2復(fù)制，降低病毒RNA、蛋白表達(dá)及病毒斑塊形成。作用階段分析表明，PN-1主要作用于病毒復(fù)制早期，對(duì)病毒吸附與進(jìn)入過程無影響。此外，PN-1對(duì)DENV-1和DENV-3同樣具有抑制活性，提示其具備跨血清型抗病毒潛力。在ICR鼠和AG129小鼠模型中，PN-1治療能顯著緩解病毒感染引起的體重下降、臨床癥狀及組織病理?yè)p傷，并提高存活率（圖4）。在AG129小鼠中，PN-1還可降低血清病毒載量，減輕肝臟、小腸和結(jié)腸的病理?yè)p傷。
 

圖4. PN-1處理顯著降低因病毒DENV-2引起的AG129小鼠生存危機(jī)

 

4.氫氘交換質(zhì)譜HDXMS在機(jī)制闡釋中的關(guān)鍵作用

本研究通過HDX-MS技術(shù)，從蛋白質(zhì)構(gòu)象動(dòng)力學(xué)層面揭示了PN-1的作用機(jī)制。該技術(shù)通過監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)肽鍵氫與氘的交換速率，反映蛋白質(zhì)局部結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)性與溶劑可及性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：

交換率降低的區(qū)域：主要位于拇指（thumb)結(jié)構(gòu)域及部分指掌區(qū)，提示PN-1結(jié)合后這些區(qū)域構(gòu)象更穩(wěn)定或更封閉，可能與活性口袋變構(gòu)調(diào)控有關(guān)；

交換率升高的區(qū)域：分布于其他指(finger)掌(palm)區(qū)段，提示局部結(jié)構(gòu)可能變得更動(dòng)態(tài)或更暴露。這些數(shù)據(jù)不僅證實(shí)PN-1與RdRp發(fā)生物理結(jié)合，更重要的是闡明其通過變構(gòu)調(diào)控機(jī)制改變酶的功能構(gòu)象，從而抑制其催化活性。

HDX-MS所提供的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)信息，為理解PN-1作為非核苷類抑制劑的分子機(jī)制提供了直接證據(jù)。

PN-1作為首個(gè)被發(fā)現(xiàn)可通過共價(jià)修飾RdRp并變構(gòu)調(diào)控其功能的天然來源非核苷類抑制劑，具有廣譜應(yīng)用潛力。由于RdRp在RNA病毒中相對(duì)保守，提示PN-1可能對(duì)黃病毒科其他成員（如寨卡病毒、丙肝病毒）也具有抑制活性。