如何提高 CHO 細胞蛋白表達量
近些年，安全高效穩(wěn)定的生物制品生產加工工藝一直是從業(yè)者不斷完善追求的目標。在重組藥物工藝中，CHO細胞已經成為需要復雜翻譯后修飾的治療性蛋白及單抗藥物生產的首選宿主細胞。CHO細胞培養(yǎng)基開發(fā)也隨之成為重中之重。其中保證生產培養(yǎng)基的無菌性是保障生產過程安全穩(wěn)定的基礎。
重組蛋白類新冠疫苗的生產方法
蛋白聚體是什么
蛋白質至少具有三級結構，這種情況下的蛋白質就是單體蛋白質（也稱為亞基）。而所謂蛋白聚體，是蛋白質的四級結構，指的是由亞基的空間排布和亞基次級鍵間的相互連接而組成的三維空間結構。每一種亞基會有兩條或兩條以上肽鏈通過非共價鍵構成蛋白質稱為寡聚蛋白。亞基的種類多為一種或兩種蛋白，任何一亞基單獨存在都不具有完整的生物學功能。比如遍布人體的血紅蛋白，就是一個由四個亞基（兩種）組成的寡聚蛋白，完整的聚體結構下具有輸氧及其他功能。又比如自2020年起就名聲大噪的冠狀病毒棘突糖蛋白，也稱S蛋白，也是在多亞基的協(xié)同作用下完成其生物學功能。
S蛋白介紹
S蛋白是一種高度糖基化的三聚體蛋白，廣泛地分布于病毒衣殼，具有識別并結合宿主細胞受體并促使病毒感染宿主細胞的功能。2020年2月19日，在新冠疫情爆發(fā)的3個月后，有一位美國科學家撰寫的文章發(fā)表于Science，作者首次利用冷凍電鏡技術揭露了SARS-CoV-2病毒表面S蛋白三聚體的高清結構，并發(fā)現(xiàn)該蛋白先結合細胞表面的ACE2受體，然后發(fā)生“變形”，將病毒包膜與細胞膜融為一體，從而將病毒內的遺傳物質注入細胞，達到感染細胞的目的。
所謂“變形”，即位于S蛋白的受體結合結構域（Receptor binding domain，RBD）在未識別人血管緊張素轉化酶（ACE2）受體之前，處于“向下收縮”（Fig1 a.）構象, 該構像相對穩(wěn)定。在識別受體時，RBD”向上突出”(Fig1 b)，使其暴露，則可與ACE2受體結合，進而完成整個感染過程。該發(fā)現(xiàn)從機制上闡明了新冠病毒感染細胞的途徑。無獨有偶，科學家們從對抗MERS開始，就已經發(fā)現(xiàn)冠狀病毒的RBD是有效的中和抗體結合位點。理論上，如果疫苗產生的抗體能中和病毒S蛋白，病毒就沒法與人體細胞結合，也就阻斷了病毒的感染。這一發(fā)現(xiàn)使眾多藥企都將RBD作為藥物開發(fā)的重要靶點。
國內已有的聚體亞單位疫苗聚體設計路線
國內已有的亞單位疫苗包括最早上市的安徽智飛龍科馬重組亞單位新冠疫苗（二聚體RBD，CHO細胞表達）還有已經和聯(lián)合國簽訂采購協(xié)議的四川三葉草重組亞單位新冠疫苗（三聚體S蛋白, CHO細胞表達）。當然也有單體的重組亞單位疫苗，比如成都威斯克(單體，昆蟲細胞表達)。
龍科馬的二聚體RBD疫苗
中國科學院微生物所和智飛龍科馬合作，通過重組表達的方法，將RBD通過二硫鍵串聯(lián)起來，經過CHO細胞表達和下游純化，獲得重組二聚體抗原。在免疫小鼠之后，二聚體RBD組產生的中和抗體顯著高于單體RDB組（Fig 3）。最新公布的三期臨床數(shù)據顯示：共28500人，其中疫苗組14251例、安慰劑組14249例。監(jiān)測到全程接種后的主要終點病例數(shù)221例，對于任何程度COVID-19感染的保護效力為81.8%，達到世界衛(wèi)生組織要求的有效性標準。其中對于新冠重癥及以上病例、死亡病例的保護效力均為100%。對Alpha株的保護效力為92.9%；對Delta株的保護效力為77.5%。
四川三葉草三聚體重組亞單位新冠疫苗
三葉草對S蛋白進行截取，選擇可溶片段作為抗原（Fig 4. A），在獨創(chuàng)的專利技術Trimer-tag加持下，通過CHO細胞表達和純化，制得S蛋白三聚體疫苗。Trimmer-tag技術，簡單來說是通過DNA重組技術，表達出可自發(fā)三聚化的纖維狀膠原蛋白，然后將任意可溶性蛋白（此處即為S蛋白可溶片段）通過二硫鍵與膠原蛋白融合表達，最終獲得三聚體蛋白的技術。
該疫苗不僅能有效對抗阿爾法毒株的感染，對上其他變異株也有不俗表現(xiàn)。在上個月新發(fā)布的2/3期臨床報告中顯示：共入組了超過30,000 名成年和老年受試者，在保護效力分析中100% 的SARS-CoV-2（新冠病毒）均為變異株（Delta變異株為主）。該疫苗預防任何毒株引起的重度和需住院治療的新冠肺炎（COVID-19）保護效力為100%，對中度至重度新冠肺炎的保護效力為84%，對目前全球占主導地位的德爾塔（Delta）變異株引起的任何嚴重程度新冠肺炎的保護效力為79%。
細胞培養(yǎng)基選擇方案
綜上，無論是生產單體還是聚體，現(xiàn)今的重組亞單位疫苗都選擇了真核細胞體系進行表達，其中以CHO細胞最為突出。Cytiva旗下的HyClone為CHO細胞表達提供最優(yōu)質的培養(yǎng)基解決方案。
Cytiva（思拓凡）——HyClone™ ActiPro™ 細胞培養(yǎng)基
ActiPro™ 細胞培養(yǎng)基是一種化學成分限定的，不含動物來源成分，符合法規(guī)要求的培養(yǎng)基。通過組分優(yōu)化以在分批培養(yǎng)或流加培養(yǎng)中獲得高蛋白產量。ActiProm 培養(yǎng)基不含任何生長因子(如胰島素)，多肽，水解物，酚紅或 2-巰基乙醇等，確保產品批間一致性和提高細胞培養(yǎng)工藝的效率。ActiPro" 培養(yǎng)基適和與 HyClone" ActiSM培養(yǎng)基，Cell Boostm7a和Cell Boostm 7b 補料培養(yǎng)基配合使用,ActisM™ 培養(yǎng)基作為一種精簡的化學成分限定的培養(yǎng)基，不含甘氨酸，次黃嘌呤，胸腺嘧啶，被開發(fā)用于馴化細胞到 ActiPro"培養(yǎng)基，一旦細胞適應到 ActiProm培養(yǎng)基中，建議使用 ActiProm 培養(yǎng)基結合 Cell Boost"w 7a和 Cell Boostm 7b 補料培養(yǎng)基進行生產。ActiPro™ 系統(tǒng)適用于多種 CHO 細胞系例如 CHO-K1，CHO-DG44 和CHO-S。
ActiPro™ 培養(yǎng)基特點
化學成分限定，不含動物源成分面
不含次黃嘌呤和胸腺嘧啶(HT)
代謝途徑設計達到抗體和蛋白的高產量(例如，MAbS>5g/L)
Cytiva的基礎培養(yǎng)基Actipro，是一款化學成分限定（CD），無動物源成分（ADCF）的培養(yǎng)基，為CHO細胞而開發(fā)。支持細胞高效生長，蛋白高效表達。與之搭配的Cell boost 7a/7b 補料同樣也是CD和ADCF培養(yǎng)基，經過精心配方開發(fā)，搭配Actipro使用，在流加批次工藝中可高效表達重組蛋白。
Cytiva（思拓凡）——HyClone™ HyCell CHO 細胞培養(yǎng)基
用于中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞培養(yǎng)的化學成分明確 (CD) 且無動物源性成分 (ADCF) 的 HyClone 培養(yǎng)基。
· HyCell™ CHO 培養(yǎng)基化學成分明確且無動物源性成分。
· 這款 CHO 細胞培養(yǎng)基適用于高收率 CHO 細胞培養(yǎng)和重組蛋白生產。
· HyClone™ HyCell CHO 可以直接或連續(xù)馴化。
· 此化學成分明確的 CHO 培養(yǎng)基適用于大規(guī)模培養(yǎng)，包括灌流和分批補料方法。
HyClone™ HyCell™ CHO 培養(yǎng)基適用于中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞培養(yǎng)的生物工藝應用領域。這款 CHO 培養(yǎng)基符合法規(guī)要求、化學成分明確 (CD) 并且無動物源性成分 (ADCF)。HyCell 培養(yǎng)基經過專門配制，具有出色的性能，CHO 細胞生成密度高，并能提高產品產量和質量。此培養(yǎng)基化學成分明確，可用于從搖瓶到大型生物反應器的多種細胞培養(yǎng)平臺的分批、分批補料或灌注應用。
含有次黃嘌呤和胸苷 (HT) 的 HyClone HyCell CHO 培養(yǎng)基是生產型培養(yǎng)基，而不含 HT 的 HyCell CHO 培養(yǎng)基與選擇系統(tǒng)兼容。請注意，為了延長保質期并與谷氨酰胺合成酶 (GS) 系統(tǒng)兼容，這些制劑均不含 L-谷氨酰胺。推薦的 L-谷氨酰胺濃度為 4 mM 至 6 mM。
HyClone™HyCell™CHO 培養(yǎng)基制劑提供液體和粉末兩種形式，可用于細胞培養(yǎng)生物工藝應用。
Cytiva的HyCell" 培養(yǎng)基是一種通用的、化學成分限定的培養(yǎng)基不含任何動物源性成分。含有次黃嘌呤和胸苷的 HyCelirCHO 培養(yǎng)基(HT)是生產培養(yǎng)基，而不含HT的HyCell"CHO培養(yǎng)基在篩選細胞時使用。該培養(yǎng)基通過我們的代謝途徑設計方法開發(fā)，其目的為在重組蛋白生產中提供一致的性能并最大化工藝產率。其通用性可令細胞快速適應周圍環(huán)境，支持細胞快速增長及較高的細胞密度，同時還能提供比其它 CHO 細胞培養(yǎng)基更高的生產能力。
在重組蛋白類新冠疫苗的研發(fā)與生產中，CHO細胞作為核心表達系統(tǒng)，其蛋白表達量直接關乎疫苗的產能與應用價值，而優(yōu)質的培養(yǎng)基正是解鎖CHO細胞高效表達潛力的關鍵。對于追求高蛋白產量的生物制藥企業(yè)與科研機構而言，Cytiva（思拓凡）旗下的HyClone™系列培養(yǎng)基無疑是理想選擇。
思拓凡旗下的HyClone™ ActiPro™ 細胞培養(yǎng)基憑借化學成分限定、無動物源成分的嚴苛標準，通過精準的代謝途徑優(yōu)化，在分批或流加培養(yǎng)中可實現(xiàn)超5g/L的單抗產量，搭配Cell Boost™ 7a/7b補料培養(yǎng)基，更能進一步激發(fā)CHO細胞的蛋白表達活力；而HyClone™ HyCell™ CHO培養(yǎng)基則以出色的通用性與高適配性，支持細胞快速增殖與高密度培養(yǎng)，在大規(guī)模生產中持續(xù)穩(wěn)定地提升重組蛋白產出。這兩款培養(yǎng)基均經過實際應用驗證，為安徽智飛龍科馬、四川三葉草等企業(yè)的疫苗生產提供了可靠支撐，助力其優(yōu)質疫苗順利推向市場并獲得廣泛認可。
未來，隨著生物制藥技術的不斷精進，CHO細胞培養(yǎng)基的創(chuàng)新將持續(xù)聚焦于更高表達效率、更優(yōu)批間一致性的核心需求。Cytiva也將不斷深耕技術研發(fā)，以更具針對性的培養(yǎng)基解決方案，賦能全球生物制品行業(yè)，為更多高效、安全的重組蛋白藥物與疫苗的研發(fā)生產注入強勁動力，推動生物醫(yī)藥領域朝著高質量、規(guī)�；姆较蚍�(wěn)步前行。
重組蛋白類新冠疫苗的生產方法
蛋白聚體是什么
蛋白質至少具有三級結構，這種情況下的蛋白質就是單體蛋白質（也稱為亞基）。而所謂蛋白聚體，是蛋白質的四級結構，指的是由亞基的空間排布和亞基次級鍵間的相互連接而組成的三維空間結構。每一種亞基會有兩條或兩條以上肽鏈通過非共價鍵構成蛋白質稱為寡聚蛋白。亞基的種類多為一種或兩種蛋白，任何一亞基單獨存在都不具有完整的生物學功能。比如遍布人體的血紅蛋白，就是一個由四個亞基（兩種）組成的寡聚蛋白，完整的聚體結構下具有輸氧及其他功能。又比如自2020年起就名聲大噪的冠狀病毒棘突糖蛋白，也稱S蛋白，也是在多亞基的協(xié)同作用下完成其生物學功能。
S蛋白介紹
S蛋白是一種高度糖基化的三聚體蛋白，廣泛地分布于病毒衣殼，具有識別并結合宿主細胞受體并促使病毒感染宿主細胞的功能。2020年2月19日，在新冠疫情爆發(fā)的3個月后，有一位美國科學家撰寫的文章發(fā)表于Science，作者首次利用冷凍電鏡技術揭露了SARS-CoV-2病毒表面S蛋白三聚體的高清結構，并發(fā)現(xiàn)該蛋白先結合細胞表面的ACE2受體，然后發(fā)生“變形”，將病毒包膜與細胞膜融為一體，從而將病毒內的遺傳物質注入細胞，達到感染細胞的目的。
所謂“變形”，即位于S蛋白的受體結合結構域（Receptor binding domain，RBD）在未識別人血管緊張素轉化酶（ACE2）受體之前，處于“向下收縮”（Fig1 a.）構象, 該構像相對穩(wěn)定。在識別受體時，RBD”向上突出”(Fig1 b)，使其暴露，則可與ACE2受體結合，進而完成整個感染過程。該發(fā)現(xiàn)從機制上闡明了新冠病毒感染細胞的途徑。無獨有偶，科學家們從對抗MERS開始，就已經發(fā)現(xiàn)冠狀病毒的RBD是有效的中和抗體結合位點。理論上，如果疫苗產生的抗體能中和病毒S蛋白，病毒就沒法與人體細胞結合，也就阻斷了病毒的感染。這一發(fā)現(xiàn)使眾多藥企都將RBD作為藥物開發(fā)的重要靶點。
國內已有的聚體亞單位疫苗聚體設計路線
國內已有的亞單位疫苗包括最早上市的安徽智飛龍科馬重組亞單位新冠疫苗（二聚體RBD，CHO細胞表達）還有已經和聯(lián)合國簽訂采購協(xié)議的四川三葉草重組亞單位新冠疫苗（三聚體S蛋白, CHO細胞表達）。當然也有單體的重組亞單位疫苗，比如成都威斯克(單體，昆蟲細胞表達)。
龍科馬的二聚體RBD疫苗
中國科學院微生物所和智飛龍科馬合作，通過重組表達的方法，將RBD通過二硫鍵串聯(lián)起來，經過CHO細胞表達和下游純化，獲得重組二聚體抗原。在免疫小鼠之后，二聚體RBD組產生的中和抗體顯著高于單體RDB組（Fig 3）。最新公布的三期臨床數(shù)據顯示：共28500人，其中疫苗組14251例、安慰劑組14249例。監(jiān)測到全程接種后的主要終點病例數(shù)221例，對于任何程度COVID-19感染的保護效力為81.8%，達到世界衛(wèi)生組織要求的有效性標準。其中對于新冠重癥及以上病例、死亡病例的保護效力均為100%。對Alpha株的保護效力為92.9%；對Delta株的保護效力為77.5%。
三葉草對S蛋白進行截取，選擇可溶片段作為抗原（Fig 4. A），在獨創(chuàng)的專利技術Trimer-tag加持下，通過CHO細胞表達和純化，制得S蛋白三聚體疫苗。Trimmer-tag技術，簡單來說是通過DNA重組技術，表達出可自發(fā)三聚化的纖維狀膠原蛋白，然后將任意可溶性蛋白（此處即為S蛋白可溶片段）通過二硫鍵與膠原蛋白融合表達，最終獲得三聚體蛋白的技術。
該疫苗不僅能有效對抗阿爾法毒株的感染，對上其他變異株也有不俗表現(xiàn)。在上個月新發(fā)布的2/3期臨床報告中顯示：共入組了超過30,000 名成年和老年受試者，在保護效力分析中100% 的SARS-CoV-2（新冠病毒）均為變異株（Delta變異株為主）。該疫苗預防任何毒株引起的重度和需住院治療的新冠肺炎（COVID-19）保護效力為100%，對中度至重度新冠肺炎的保護效力為84%，對目前全球占主導地位的德爾塔（Delta）變異株引起的任何嚴重程度新冠肺炎的保護效力為79%。
細胞培養(yǎng)基選擇方案
綜上，無論是生產單體還是聚體，現(xiàn)今的重組亞單位疫苗都選擇了真核細胞體系進行表達，其中以CHO細胞最為突出。Cytiva旗下的HyClone為CHO細胞表達提供最優(yōu)質的培養(yǎng)基解決方案。
Cytiva（思拓凡）——HyClone™ ActiPro™ 細胞培養(yǎng)基
ActiPro™ 細胞培養(yǎng)基是一種化學成分限定的，不含動物來源成分，符合法規(guī)要求的培養(yǎng)基。通過組分優(yōu)化以在分批培養(yǎng)或流加培養(yǎng)中獲得高蛋白產量。ActiProm 培養(yǎng)基不含任何生長因子(如胰島素)，多肽，水解物，酚紅或 2-巰基乙醇等，確保產品批間一致性和提高細胞培養(yǎng)工藝的效率。ActiPro" 培養(yǎng)基適和與 HyClone" ActiSM培養(yǎng)基，Cell Boostm7a和Cell Boostm 7b 補料培養(yǎng)基配合使用,ActisM™ 培養(yǎng)基作為一種精簡的化學成分限定的培養(yǎng)基，不含甘氨酸，次黃嘌呤，胸腺嘧啶，被開發(fā)用于馴化細胞到 ActiPro"培養(yǎng)基，一旦細胞適應到 ActiProm培養(yǎng)基中，建議使用 ActiProm 培養(yǎng)基結合 Cell Boost"w 7a和 Cell Boostm 7b 補料培養(yǎng)基進行生產。ActiPro™ 系統(tǒng)適用于多種 CHO 細胞系例如 CHO-K1，CHO-DG44 和CHO-S。
ActiPro™ 培養(yǎng)基特點
化學成分限定，不含動物源成分面
不含次黃嘌呤和胸腺嘧啶(HT)
代謝途徑設計達到抗體和蛋白的高產量(例如，MAbS>5g/L)
Cytiva（思拓凡）——HyClone™ HyCell CHO 細胞培養(yǎng)基
用于中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞培養(yǎng)的化學成分明確 (CD) 且無動物源性成分 (ADCF) 的 HyClone 培養(yǎng)基。
· HyCell™ CHO 培養(yǎng)基化學成分明確且無動物源性成分。
· 這款 CHO 細胞培養(yǎng)基適用于高收率 CHO 細胞培養(yǎng)和重組蛋白生產。
· HyClone™ HyCell CHO 可以直接或連續(xù)馴化。
· 此化學成分明確的 CHO 培養(yǎng)基適用于大規(guī)模培養(yǎng)，包括灌流和分批補料方法。
HyClone™ HyCell™ CHO 培養(yǎng)基適用于中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞培養(yǎng)的生物工藝應用領域。這款 CHO 培養(yǎng)基符合法規(guī)要求、化學成分明確 (CD) 并且無動物源性成分 (ADCF)。HyCell 培養(yǎng)基經過專門配制，具有出色的性能，CHO 細胞生成密度高，并能提高產品產量和質量。此培養(yǎng)基化學成分明確，可用于從搖瓶到大型生物反應器的多種細胞培養(yǎng)平臺的分批、分批補料或灌注應用。
含有次黃嘌呤和胸苷 (HT) 的 HyClone HyCell CHO 培養(yǎng)基是生產型培養(yǎng)基，而不含 HT 的 HyCell CHO 培養(yǎng)基與選擇系統(tǒng)兼容。請注意，為了延長保質期并與谷氨酰胺合成酶 (GS) 系統(tǒng)兼容，這些制劑均不含 L-谷氨酰胺。推薦的 L-谷氨酰胺濃度為 4 mM 至 6 mM。
HyClone™HyCell™CHO 培養(yǎng)基制劑提供液體和粉末兩種形式，可用于細胞培養(yǎng)生物工藝應用。
Cytiva的HyCell" 培養(yǎng)基是一種通用的、化學成分限定的培養(yǎng)基不含任何動物源性成分。含有次黃嘌呤和胸苷的 HyCelirCHO 培養(yǎng)基(HT)是生產培養(yǎng)基，而不含HT的HyCell"CHO培養(yǎng)基在篩選細胞時使用。該培養(yǎng)基通過我們的代謝途徑設計方法開發(fā)，其目的為在重組蛋白生產中提供一致的性能并最大化工藝產率。其通用性可令細胞快速適應周圍環(huán)境，支持細胞快速增長及較高的細胞密度，同時還能提供比其它 CHO 細胞培養(yǎng)基更高的生產能力。
在重組蛋白類新冠疫苗的研發(fā)與生產中，CHO細胞作為核心表達系統(tǒng)，其蛋白表達量直接關乎疫苗的產能與應用價值，而優(yōu)質的培養(yǎng)基正是解鎖CHO細胞高效表達潛力的關鍵。對于追求高蛋白產量的生物制藥企業(yè)與科研機構而言，Cytiva（思拓凡）旗下的HyClone™系列培養(yǎng)基無疑是理想選擇。
思拓凡旗下的HyClone™ ActiPro™ 細胞培養(yǎng)基憑借化學成分限定、無動物源成分的嚴苛標準，通過精準的代謝途徑優(yōu)化，在分批或流加培養(yǎng)中可實現(xiàn)超5g/L的單抗產量，搭配Cell Boost™ 7a/7b補料培養(yǎng)基，更能進一步激發(fā)CHO細胞的蛋白表達活力；而HyClone™ HyCell™ CHO培養(yǎng)基則以出色的通用性與高適配性，支持細胞快速增殖與高密度培養(yǎng)，在大規(guī)模生產中持續(xù)穩(wěn)定地提升重組蛋白產出。這兩款培養(yǎng)基均經過實際應用驗證，為安徽智飛龍科馬、四川三葉草等企業(yè)的疫苗生產提供了可靠支撐，助力其優(yōu)質疫苗順利推向市場并獲得廣泛認可。
未來，隨著生物制藥技術的不斷精進，CHO細胞培養(yǎng)基的創(chuàng)新將持續(xù)聚焦于更高表達效率、更優(yōu)批間一致性的核心需求。Cytiva也將不斷深耕技術研發(fā)，以更具針對性的培養(yǎng)基解決方案，賦能全球生物制品行業(yè)，為更多高效、安全的重組蛋白藥物與疫苗的研發(fā)生產注入強勁動力，推動生物醫(yī)藥領域朝著高質量、規(guī)�；姆较蚍�(wěn)步前行。
