流式細(xì)胞儀的基本原理及液路系統(tǒng)、光路系統(tǒng)以及電子系統(tǒng)的作用

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometery)是利用流式細(xì)胞儀(flow cytometer)對(duì)快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒等進(jìn)行逐個(gè)、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選的技術(shù)，具有檢測(cè)速度快、測(cè)量參數(shù)多、采集數(shù)據(jù)量大、分析信息全面、分選純度高、方法靈活等特點(diǎn)，可用于細(xì)胞大小、細(xì)胞顆粒度、DNA及RNA含量、蛋白質(zhì)含量、細(xì)胞特異抗原、細(xì)胞活性、胞內(nèi)PH值、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞功能分析等的檢測(cè)。

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析
abs50001 Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒

FITC Annexin V染色的流式細(xì)胞術(shù)分析。 Human PBMC用12uM喜樹(shù)堿處理4h。將細(xì)胞與FITC Annexin V在含有碘化丙啶(PI)的緩沖液中孵育，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。經(jīng)過(guò)2h的處理，主要有三組細(xì)胞：活細(xì)胞（FITC Annexin V和PI陰性）和凋亡早期（FITC Annexin V陽(yáng)性和PI陰性）和FITC Annexin V和PI雙陽(yáng)性的細(xì)胞。

流式細(xì)胞術(shù)的基本原理
深入了解流式細(xì)胞術(shù)的基本原理，必須了解流式細(xì)胞儀，流式細(xì)胞儀的基本元件包括液路系統(tǒng)、光路系統(tǒng)以及電子系統(tǒng)三個(gè)部分。

液路系統(tǒng)：確保細(xì)胞單個(gè)排列通過(guò)，每次分析一個(gè)細(xì)胞；
光路系統(tǒng)：產(chǎn)生、收集、分離和轉(zhuǎn)換光信號(hào)，為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析提供基礎(chǔ)；
電子系統(tǒng)：處理和保存由光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)到的信號(hào)，并將這些信號(hào)轉(zhuǎn)換為可用于分析的數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)。

液路系統(tǒng)
液路系統(tǒng)的作用是將樣品排列成單列細(xì)胞/顆粒流，并使細(xì)胞/顆粒穩(wěn)定高速的通過(guò)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)點(diǎn)，主要包含流動(dòng)室+鞘液+廢液+上樣器+壓力控制系統(tǒng)

● 上樣速度越高，樣本中心液流(sample core)越粗，激光聚焦越差，分辨率越低；
● 定性測(cè)量一般對(duì)流速要求不高，例如免疫分型；
● 定量測(cè)量嚴(yán)格要求低速，例如細(xì)胞周期檢測(cè)。

流式細(xì)胞中的光信號(hào)
1、散射光信號(hào)
散射光信號(hào)是細(xì)胞的固有參數(shù)，不需要使用熒光標(biāo)簽；

● 前向散射光(forward scatter)：FSC信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小相關(guān)；
● 側(cè)向散射光(side scatter)：SSC信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少相關(guān)；
● FSC-SSC的作用：利用細(xì)胞大小和顆粒度初步區(qū)分細(xì)胞群、去除細(xì)胞碎片、去除黏連細(xì)胞。

從細(xì)胞進(jìn)入激光照射區(qū)到離開(kāi)，產(chǎn)生一個(gè)電脈沖信號(hào)。H是脈沖高度，代表脈沖信號(hào)的峰值；W是脈沖寬度，是指細(xì)胞通過(guò)激光照射區(qū)域的時(shí)間；A是脈沖信號(hào)的面積。

實(shí)際操作中，部分細(xì)胞與細(xì)胞會(huì)粘在一起，連續(xù)通過(guò)激光照射區(qū)，被儀器認(rèn)定為一次信號(hào)，對(duì)我們最終的數(shù)據(jù)分析造成干擾。當(dāng)粘連體出現(xiàn)測(cè)量高度不變，寬度和面積變?yōu)閮杀�，即出現(xiàn)FSC-Height不變，F(xiàn)SC-Area和Width增大的現(xiàn)象。

我們可以使用FSC-A與FSC-H來(lái)排除粘連體，正常單細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀激光照射區(qū)時(shí)，H和A是成正比增大的，而粘連體通過(guò)時(shí)，H不變，A增大，因此，可通過(guò)細(xì)胞的FSC-A(Area)與FSC-H(Height)參數(shù)完美排除掉粘連體，也可以通過(guò)FSC-H與FSC-W來(lái)操作，但此種方法對(duì)于復(fù)雜樣本（樣本中各種細(xì)胞大小差異較大）不太適用，實(shí)際上，去除粘連體的重要步驟在樣本制備階段。

2、熒光信號(hào)
在流式細(xì)胞術(shù)中，熒光信號(hào)的產(chǎn)生是由于特定的熒光素分子吸收一定波長(zhǎng)的光后躍遷到激發(fā)態(tài)，然后釋放光子（熒光）回到基態(tài)。了解熒光信號(hào)的產(chǎn)生以及各部分元件，有助于我們多色配色。

激光：提供單色光束，用于激發(fā)細(xì)胞中的熒光標(biāo)記物，常見(jiàn)激光器有355nm（紫外）、405nm（紫色）、488nm（藍(lán)色）、561nm（黃綠色）、633nm（紅色）。有的流式細(xì)胞儀只配備488nm；有的流式細(xì)胞儀配備兩種激光器如488nm與638nm。多色流式則可能需要更多的激光器。

濾光片：通常包括帶通濾光片、長(zhǎng)通濾光片、短通濾光片，帶通濾光片。帶通濾光片允許一個(gè)固定范圍內(nèi)波長(zhǎng)的光通過(guò)。如BP530/30表示允許波長(zhǎng)515nm-545nm范圍的光通過(guò)，長(zhǎng)通允許特定波長(zhǎng)以上的光通過(guò)，特定波長(zhǎng)以下的光不能通過(guò)。短通濾光片使特定波長(zhǎng)以下的光通過(guò)。

分光棱鏡：將激光器發(fā)出的光線和細(xì)胞散射或熒光發(fā)射出來(lái)的光線分開(kāi)，確保不同顏色的熒光可以被不同的檢測(cè)器準(zhǔn)確地捕捉到。

熒光信號(hào)檢測(cè)器：檢測(cè)分光棱鏡分離出的熒光信號(hào)。每個(gè)檢測(cè)器對(duì)應(yīng)一個(gè)特定的熒光波長(zhǎng)，用于測(cè)量細(xì)胞中特定熒光標(biāo)記物的強(qiáng)度。

電子系統(tǒng)

主要負(fù)責(zé)處理和數(shù)字化由光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)到的光信號(hào)

放大：當(dāng)細(xì)胞或顆粒通過(guò)檢測(cè)點(diǎn)時(shí)，激光束照射到它們上產(chǎn)生的光信號(hào)（包括前向角散射(FSC)、側(cè)向散射(SSC)和熒光信號(hào)）被光電倍增管(PMT)或光電二極管(PD)探測(cè)到，并轉(zhuǎn)化為電信號(hào)。這些初始的電信號(hào)通常很弱，需要通過(guò)信號(hào)放大器進(jìn)行放大。

模數(shù)轉(zhuǎn)換(ADC)：放大后的電信號(hào)通過(guò)模數(shù)轉(zhuǎn)換器(ADC)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)。ADC的位數(shù)（如14到24位）決定了信號(hào)的解析率和能轉(zhuǎn)化的數(shù)值范圍。

脈沖分箱(Pulse Processing)：每個(gè)細(xì)胞的所有參數(shù)的電壓脈沖會(huì)被進(jìn)行分箱，即按照一定的采樣率和ADC的解析率，將模擬信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，并存儲(chǔ)為數(shù)據(jù)以備后續(xù)分析。

數(shù)據(jù)存儲(chǔ)與分析：數(shù)字信號(hào)被傳送到電腦，存儲(chǔ)為數(shù)據(jù)文件，以備分析。這些數(shù)據(jù)文件通常以標(biāo)準(zhǔn)的流式細(xì)胞儀文件格式輸出，如FSC數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)文件。

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