機械刺激馬源骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細胞體外軟骨模型可觸發(fā)骨關(guān)節(jié)炎特征

Mechanical Stimulation of Equine Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cell-Derived Cartilage-Like In Vitro Model Triggers Osteoarthritis Features

Keywords: chondrocytes; equine cartilage; in vitro model; mechanical compression; mesenchymal stromal cells; osteoarthritis.

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種影響世界數(shù)百萬人的普遍疾病，尤其是對人類和馬匹的影響。這種衰弱性疾病的特征是不可逆的軟骨退化、慢性炎癥和關(guān)節(jié)功能的下降，由機械和生化因素驅(qū)動。機械負荷在軟骨細胞調(diào)節(jié)的軟骨穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用，并已被證明可以影響細胞行為。然而，損傷性負荷會對軟骨產(chǎn)生不利影響。體外研究表明，過度壓縮負荷與細胞死亡增加（包括細胞壞死和凋亡）、蛋白聚糖的釋放，以及細胞外基質(zhì)（ECM）的退化有關(guān)。

點擊了解：仿生壓力細胞培養(yǎng)儀

軟骨細胞是軟骨中的主要細胞類型，主要通過整合素-基質(zhì)相互作用、機械敏感離子通道的激活（如瞬時受體電位香草素（TRPV）通道或 Piezo-通道）以及初級纖毛誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)感知和響應(yīng)機械負荷。間充質(zhì)基質(zhì)細胞（MSCs）也可以感知機械刺激（MS），特別是通過 TRPV4，這會影響 ECM 穩(wěn)態(tài)和組成。

動物模型，包括小型和大型動物的自發(fā)性和誘導(dǎo)性 OA，對于評估 OA 新興治療方法的治療潛力至關(guān)重要。大型動物模型，如馬，在解剖結(jié)構(gòu)上與人類相似，對于研究 OA 進展和改進治療特別有價值�；�于此，法國卡昂諾曼底大學(xué)聯(lián)合研究實驗室BIOTARGEN UR7450團隊的一項研究利用馬骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細胞（BM-MSC）構(gòu)建體外OA模型，對 MSC 衍生的軟骨細胞施加壓縮力，并評估細胞感知 MS 的能力以及 MS 對細胞活力、ECM 組成和關(guān)節(jié)軟骨標志物表達的影響。研究成果發(fā)表于 ACS Biomaterials Science & Engineering 期刊題為“Mechanical Stimulation of Equine Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cell-Derived Cartilage-Like In Vitro Model Triggers Osteoarthritis Features”。

首先，研究人員通過將馬 BM-MSCs 接種在膠原蛋白海綿并在軟骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)構(gòu)建了軟骨樣體外模型（圖1 A）。然后比較了MSCs、MSCs衍生的軟骨細胞和馬關(guān)節(jié)軟骨分離的軟骨細胞中TRPV4的轉(zhuǎn)錄水平。有趣的是，MSCs向軟骨細胞的分化誘導(dǎo) TRPV4 水平增加 100 倍（圖1 B）。為了確認MSCs來源的軟骨細胞可以感知機械刺激（MS），軟骨樣體外模型在靜態(tài)條件下或以 2.5 kPa、0.2Hz的壓縮幅度進行 MS 15 分鐘（圖1 A）。正如預(yù)期，實驗觀察到 MS 下，P44/42 MAPK 的磷酸化比靜態(tài)條件下增加（圖1 C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，MSC 衍生的軟骨細胞表達機械敏感離子 TRPV4 通道，并且可以將 MS 整合到細胞內(nèi)信號中。

圖1    馬 BM-MSC 衍生的軟骨細胞表達 TRPV4 并感知機械刺激。

下一步是研究壓縮是否影響細胞活力。為此，將馬骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細胞衍生的軟骨細胞用EdU（一種胸腺嘧啶類似物，檢測細胞增殖情況）孵育。令人驚訝的是，與靜態(tài)條件相比，MS（D24）下3天后EdU 陽性細胞的數(shù)量減少（圖2 A、B）。與對照組相比，增殖細胞核抗原（PCNA）蛋白含量明顯降低（圖2 C）。因此，MS后3天和7天，細胞核數(shù)/mm2 略有下降（圖2 F）。同時，進行了 TUNEL 測定評估對細胞凋亡的影響。無論在對照條件下還是在MS下，凋亡核的比例都很低，持續(xù)3天（D24）或7天（D28）（圖2 D、E）。此外，通過損傷細胞向培養(yǎng)基中釋放腺苷酸激酶來測量，無論持續(xù)時間如何，MS都不會誘導(dǎo)細胞毒性。這些發(fā)現(xiàn)表明，MS 對馬MSC來源的軟骨細胞可減少細胞增殖，而不影響細胞死亡或凋亡。

圖2   機械刺激減少馬 BM-MSC 衍生的軟骨細胞增殖。

接下來，實驗試圖確定 MS 是否與在軟骨樣體外模型中誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎特征相關(guān)。在施加MS后，研究了編碼ECM成分和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的基因的mRNA水平以及ECM的質(zhì)量。在靜態(tài)條件下培養(yǎng)的軟骨樣體外模型在D21和D24/D28天之間的ACAN、COL2A1、SOX9、PRG4、COL1A1和RUNX2 mRNA  水平?jīng)]有統(tǒng)計學(xué)差異，COL2A1/COL1A1 比值沒有變化，但COMP的mRNA水平在D24時降低。相反，經(jīng)歷MS后，與D21相比，COL2A1、SOX9、PRG4和RUNX2 mRNA水平升高，COL1A1保持不變，COL2A1/COL1A1比值升高，COMP 水平相似。

為了研究軟骨樣體外模型中ECM的質(zhì)量，使用Western blot 分析評估了膠原蛋白的水平，在加壓 3 天后（D24），與靜態(tài)條件下相比，MS 條件下 I 型膠原蛋白和 IIB 型膠原蛋白的含量較低，7天后（D28）I型和IIB型膠原蛋白的數(shù)量急劇減少（圖3 A）。因此，軟骨樣體外模型的MS導(dǎo)致部分ECM成分的mRNA水平增加，但未在蛋白水平上反映出來。

同時進行了組織學(xué)分析，使用不同的染色方法可視化ECM。在 21 天時，軟骨樣體外模型充滿新合成的 ECM，并在海綿中均勻分布（圖3 B）。事實上，與中心相比，在外圍觀察到更高的染色強度。無論培養(yǎng)條件如何，軟骨樣體外模型都沒有表現(xiàn)出明顯的骨化跡象，因為茜素紅染色仍然很弱。MS 3 天后（D24），與靜態(tài)條件相比，GAG（糖胺聚糖）和膠原蛋白含量減少。加壓 7 天后（D28），ECM 含量的減少變得更加明顯，特別是 II 型膠原蛋白（圖3 B、C）。

這些發(fā)現(xiàn)表明，MS 通過減少軟骨樣體外模型中的 GAG 和膠原蛋白量來損害 ECM 的質(zhì)量，而不會降低主要 ECM 成分的 mRNA 水平。

圖3    機械刺激會損害 ECM 成分的積累。

最后，實驗研究了分解代謝的增加是否會引發(fā)MS時 ECM 的改變。促炎細胞因子在誘導(dǎo)分解代謝過程中起著重要作用。在測試的 23 種細胞因子中，只有 3 種達到檢測閾值。靜態(tài)條件下，成纖維細胞生長因子2（FGF-2）、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）水平均低于檢測閾值。然而，在機械壓縮下，這三種細胞因子的濃度顯著增加，表明MS誘導(dǎo)FGF-2，G-CSF和GM-CSF的釋放或表達增加。

在OA期間參與蛋白聚糖降解的主要聚集酶ADAMTS5的mRNA水平在MS 3天后增加了約50倍（D24），并且這種趨勢在7天后持續(xù)（D28）（圖4 A）。此外，還研究了 HtrA1，一種已知在 OA 中發(fā)揮多種作用的絲氨酸蛋白酶，向減少和受損的ECM聚集。評估顯示，MS 3 天后HtrA1 蛋白水平升高，并持續(xù)到7天后（圖4 B）。同樣，MS 3 天后 MMP 活性升高（圖4 C），說明基質(zhì)酶參與觀察到的反應(yīng)。

鑒于軟骨樣體外模型ECM 的蛋白聚糖/GAG含量較高，其降解可能導(dǎo)致其釋放到培養(yǎng)基中，因此測量了培養(yǎng)基中GAG的水平。在靜態(tài)條件下（從第24天到第28天）GAG濃度似乎隨著時間的推移而增加。一個周期的MS（D21）不影響培養(yǎng)基中的GAG濃度（圖4 D）。相反，MS 在 3 天（D24）和 7 天（D28）后誘導(dǎo) GAG 和 COMP 濃度升高（圖4 D、E）。一氧化氮（NO）是 OA 中的關(guān)鍵炎癥介質(zhì)。由于NO在溶液中不穩(wěn)定，會迅速轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，因此測定了培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的濃度，發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽濃度在加壓 3 天和 7 天后顯著增加（圖4 F）。

這些發(fā)現(xiàn)表明，MS 可以增加馬 BM-MSC 衍生軟骨細胞的炎癥介質(zhì)并促進分解代謝，從而促進 ECM 降解。

圖4    馬 BM-MSC 衍生軟骨細胞的機械刺激促進分解代謝相關(guān)事件。

圖5    圖形概要

總之，這項研究強調(diào)了機械刺激與軟骨代謝之間的復(fù)雜關(guān)系，表明機械應(yīng)力可以在源自 BM-MSCs 的軟骨樣體外模型中誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎特征，如炎癥介質(zhì)、ECM 下調(diào)和蛋白酶上調(diào)。此外，這些結(jié)果強調(diào)了軟骨模型中控制機械負荷的重要性，因為過度壓縮可以模擬 OA 等關(guān)節(jié)疾病中出現(xiàn)的退行性變化。許多機械傳感器位于細胞表面，包括初級纖毛、各種離子通道（如 TRPV4 和 PIEZO）以及整合素，將機械信號轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)信號，這取決于機械刺激的大小，并且可以被周圍的微環(huán)境調(diào)節(jié)。此外，機械刺激可以直接或間接促進修飾ECM的蛋白酶的上調(diào)，從而釋放各種影響細胞行為的因子。因此，未來需要進一步的研究來充分闡明將機械刺激與軟骨樣模型中的骨關(guān)節(jié)炎特征聯(lián)系起來的機制。

參考文獻：Contentin R, Jehl C, Commenchail K, Legendre F, Galéra P, Cassé F, Demoor M. Mechanical Stimulation of Equine Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cell-Derived Cartilage-Like In Vitro Model Triggers Osteoarthritis Features. ACS Biomater Sci Eng. 2025 Jul 14;11(7):4153-4165. doi: 10.1021/acsbiomaterials.5c00500. Epub 2025 Jun 13. PMID: 40512481; PMCID: PMC12264857.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40512481/

圖片來源：所有圖片均來源于參考文獻

小編旨在分享、學(xué)習(xí)、交流生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究進展。如有侵權(quán)或引文不當請聯(lián)系小編修正。如有任何的想法以及建議，歡迎聯(lián)系小編。感謝各位的瀏覽以及關(guān)注！進入官網(wǎng)www.naturethink.com或關(guān)注“Naturethink”公眾號，了解更多相關(guān)內(nèi)容。

點擊了解：仿生壓力細胞培養(yǎng)儀