Chameleon全自動(dòng)冷凍電鏡制樣系統(tǒng)助力解析 ABCC2 近原子分辨率

在結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域，冷凍電鏡蛋白的高分辨率解析一直是 “硬骨頭”—— 這類蛋白易受制樣過程中的物理擾動(dòng)、氣液界面效應(yīng)影響，出現(xiàn)結(jié)構(gòu)域解離、顆粒取向優(yōu)勢(shì)，最終導(dǎo)致分辨率上不去、結(jié)構(gòu)不完整。

最近，國(guó)內(nèi)冷凍電鏡服務(wù)領(lǐng)軍企業(yè)佰翱得（Biortus） 與英國(guó) SPTLABTECH 的 Chameleon 全自動(dòng)冷凍電鏡制樣系統(tǒng)聯(lián)手，以 ABCC2 蛋白（ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 C 亞家族關(guān)鍵成員）為研究對(duì)象，交出了一份顛覆傳統(tǒng)制樣認(rèn)知的 “成績(jī)單”：不僅實(shí)現(xiàn)了 ABCC2 蛋白 2.51Å 近原子分辨率完整結(jié)構(gòu)解析，更驗(yàn)證了 “全新的自動(dòng)冷凍制樣” 模式在攻克難解析靶點(diǎn)時(shí)的核心優(yōu)勢(shì)。

背景
ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）是存在于所有生命形式中的一大類蛋白家族。它們是關(guān)鍵的分子機(jī)器，通過 ATP 水解供能，將多種底物跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)。其功能對(duì)許多生命過程至關(guān)重要，包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝取、毒素排出及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等。

典型的 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含兩個(gè)核心功能結(jié)構(gòu)域：

• 跨膜結(jié)構(gòu)域（TMDs）：通常由 6-12 個(gè)跨膜 α- 螺旋組成，貫穿脂質(zhì)膜，構(gòu)成底物轉(zhuǎn)運(yùn)通道，負(fù)責(zé)識(shí)別并結(jié)合特定轉(zhuǎn)運(yùn)分子。

核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（NBDs）：負(fù)責(zé)結(jié)合并水解 ATP，水解反應(yīng)釋放的能量驅(qū)動(dòng)跨膜結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象變化，使轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在向內(nèi)開放和向外開放的構(gòu)象間交替轉(zhuǎn)換，從而推動(dòng)底物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖1  典型的 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白示意圖

傳統(tǒng)制樣的 挑戰(zhàn)：ABCC2 的 NBD 結(jié)構(gòu)域?yàn)楹?ldquo;消失”？
在冷凍電鏡解析中，“制樣” 是決定后續(xù)一切的基礎(chǔ) —— 冰層質(zhì)量、顆粒完整性、取向分布，直接影響最終重構(gòu)結(jié)果。此前，常用的傳統(tǒng)濾紙吸附制樣技術(shù)，在 ABCC2 解析中暴露出明顯局限：

圖2  傳統(tǒng)制樣ABCC2 WT的3.3 Å分辨率的二維分類和三維密度圖
圖中紅色箭頭指示了缺失的NBD結(jié)構(gòu)域位置，凸顯了結(jié)構(gòu)的不完整性

如圖2，傳統(tǒng)制樣時(shí)，濾紙與樣品直接接觸產(chǎn)生的機(jī)械剪切力、數(shù)秒級(jí)的氣液界面暴露時(shí)間，導(dǎo)致 ABCC2 的脆弱結(jié)構(gòu)域（尤其是維持功能關(guān)鍵的雙 NBD 結(jié)構(gòu)域）大量解離。從2D Class數(shù)據(jù)顯示，野生型 ABCC2 完整顆粒占比極低，突變體也僅有 20% 顆粒保留雙 NBD，其余 80% 均缺失一個(gè) NBD；

最終收集 96 萬(wàn) + 顆粒進(jìn)行重構(gòu)，樣品的最佳分辨率也僅能達(dá)到 2.8Å（且為缺失 NBD 的不完整結(jié)構(gòu)），完整雙 NBD 結(jié)構(gòu)的分辨率更是卡在 3.3Å，NBD 區(qū)域局部分辨率僅 4.0Å，無(wú)法滿足精細(xì)結(jié)構(gòu)分析需求；緩慢的冷凍過程導(dǎo)致顆粒在冰層中取向集中，三維重構(gòu)缺失關(guān)鍵角度信息，進(jìn)一步限制分辨率提升。

Chameleon×佰翱得：從 “破局” 到 “極致” 的技術(shù)支持
面對(duì) ABCC2 的解析難題，Chameleon 的 “黑科技” 制樣能力與佰翱得的全流程專業(yè)服務(wù)形成了完美互補(bǔ)，直接打破了傳統(tǒng)制樣的桎梏：

作為 SPTLABTECH 推出的新一代全自動(dòng)制樣系統(tǒng)，Chameleon 的核心優(yōu)勢(shì)在于從原理上規(guī)避了傳統(tǒng)制樣的缺陷，為 ABCC2 提供了更完美的冷凍環(huán)境：

• Blot-free 無(wú)濾紙?jiān)O(shè)計(jì)：chameleon采用表面覆蓋納米纖維的自吸附載網(wǎng)，通過毛細(xì)作用自發(fā)吸附液體，完全避免濾紙與樣品的物理接觸，杜絕機(jī)械剪切力對(duì) NBD 結(jié)構(gòu)域的損傷；
• 毫秒級(jí)極速冷凍：從噴射加樣（單次僅需 6nL 樣品，大幅降低珍貴樣品消耗）到冷凍完成，使用160~400 ms不等的時(shí)間，將氣液界面暴露時(shí)間壓縮至 “瞬間”，牢牢穩(wěn)定 ABCC2 的完整構(gòu)象；
• AI 智能優(yōu)化 + 全自動(dòng)流程：內(nèi)置高速攝像機(jī)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)液層吸附過程，AI 算法推薦最優(yōu)制樣參數(shù)，不僅避免人為操作誤差，更能精準(zhǔn)控制冰層厚度 —— 這為后續(xù)高分辨成像提供了的基礎(chǔ)。

Chameleon制樣結(jié)果
 

圖3 Chameleon制樣ABCC2的2D分類結(jié)果

所有類別均清晰顯示完整的雙NBD結(jié)構(gòu)

Chameleon 制備的 ABCC2 樣品，完整雙 NBD 顆粒占比達(dá)到 100%，無(wú)論是 野生型還是突變型，均實(shí)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)完整性的 “零缺失”。

Chameleon 制備高濃度樣品（5.5mg/mL）在獲得海量高質(zhì)量顆粒（749,051個(gè)）的同時(shí)，仍能保持100%顆粒的完整性，從而將分辨率進(jìn)一步提升至2.51 Å，充分證明了該技術(shù)在處理敏感蛋白時(shí)的可靠性。且顆粒取向分布均勻，徹底解決了傳統(tǒng)制樣的核心痛點(diǎn)。

討論
傳統(tǒng)制樣依賴濾紙物理blotting來(lái)去除多余液體，這個(gè)過程不僅耗時(shí)（通常數(shù)秒），使蛋白長(zhǎng)時(shí)間暴露于氣液界面（AWI），而AWI是導(dǎo)致蛋白變性、解離或展開的主要元兇之一。同時(shí)，濾紙與樣品的直接接觸可能對(duì)脆弱的膜蛋白復(fù)合物（如ABCC2）產(chǎn)生機(jī)械剪切力，直接導(dǎo)致結(jié)構(gòu)域（如NBD）的撕裂或損傷。

而Chameleon采用超快速冷凍以及“Blot-free” 的樣品制備方式，它利用其專利的自吸附載網(wǎng)（表面覆蓋納米纖維），通過毛細(xì)作用自發(fā)吸附樣品液滴，完全避免了濾紙的物理接觸和擾動(dòng)。同時(shí)更快的制樣速度有助于緩解取向優(yōu)勢(shì)問題，促使顆粒以更隨機(jī)的方式被凍結(jié)，從而獲得更均勻的視角覆蓋，這為高分辨率重構(gòu)提供了更完整的信息基礎(chǔ)。

佰翱得
佰翱得由“中國(guó)企業(yè)500強(qiáng)”雙良集團(tuán)與多名擁有國(guó)際藥企工作經(jīng)歷的海歸科學(xué)家聯(lián)合創(chuàng)立，致力于為全球創(chuàng)新藥物研發(fā)機(jī)構(gòu)提供“以復(fù)雜蛋白制備為基礎(chǔ)，以結(jié)構(gòu)生物學(xué)為核心，以冷凍電鏡為特色”的新藥早期研發(fā)服務(wù)，打造國(guó)際高端結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域領(lǐng)軍品牌。

自2009年以來(lái)，佰翱得已與全球各領(lǐng)域的研究機(jī)構(gòu)、生物技術(shù)公司和制藥公司建立了眾多合作關(guān)系，其業(yè)務(wù)遍布中國(guó)以及波士頓、舊金山、圣地亞哥、新澤西等生物醫(yī)藥企業(yè)聚集地。欲了解更多信息，請(qǐng)?jiān)L問en.biortus.bio，或關(guān)注其相關(guān)公眾號(hào)。

SPT Labtech
SPT Labtech China總部位于上海，系英國(guó)SPT Labtech Group全資子公司，專注于生命科學(xué)研究領(lǐng)域自動(dòng)化儀器及耗材的設(shè)計(jì)與開發(fā)，在過去20多年里設(shè)計(jì)并制造了功能強(qiáng)大、可靠且易于使用的微升級(jí)/納升級(jí)移液工作站、自動(dòng)化生物樣本庫(kù)，同時(shí)提供了在冷凍電鏡和藥物研發(fā)領(lǐng)域的解決方案，極大提升了科學(xué)家的科研能力。這些產(chǎn)品簡(jiǎn)化了關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)流程，顯著提高了藥物研發(fā)、基因組學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)及生物樣本庫(kù)自動(dòng)化管理的靈活性、效率和通量生產(chǎn)率。更多信息，請(qǐng)?jiān)L問www.sptlabtech.cn。