表達早老蛋白的內皮細胞無法適應剪切應力

Progerin-expressing endothelial cells are unable to adapt to shear stress

Keywords: HGPS; ECs; fluid shear stress; lamin A; ZMPSTE24; cell loss; nuclear abnormalities; lonafarnib; methylstat.

核纖層作為核膜內膜與染色質間的纖維蛋白網絡，具有支持細胞核結構、影響核形態(tài)、基因調控及細胞分裂時核組裝解體等作用，且在力作用下有機械適應和響應特性。早老癥（HGPS）由 LMNA 基因的常染色體顯性突變引發(fā)，該突變導致異常早老蛋白產生，其因缺失特定切割位點而yongjiu法尼基化，這是該病關鍵特征，ZMPSTE24 敲除小鼠的表現(xiàn)可佐證。早老蛋白在核周積累，會改變核纖層結構，引發(fā)核形態(tài)異常、硬度增加、異染色質重分布等一系列核缺陷。

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HGPS 患者會因加速性動脈粥樣硬化引發(fā)心臟病、中風等導致早逝，其心血管異常與衰老個體的動脈粥樣硬化表現(xiàn)相似，但不存在傳統(tǒng)危險因素。目前關鍵問題是早老蛋白如何影響血管系統(tǒng)引發(fā)快速動脈粥樣硬化。研究發(fā)現(xiàn)，該病特征之一是大動脈血管平滑肌細胞丟失，而血管平滑肌細胞中早老蛋白的表達會損害細胞增殖、削弱對生理牽張力的響應、降低血管反應性，并通過誘導內質網應激加速動脈粥樣硬化。早老蛋白還會影響內皮細胞功能，相關小鼠模型顯示其會引發(fā)炎癥、血管形成受損、心臟病變等，且內皮細胞機械響應能力受損。

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基于此，弗吉尼亞聯(lián)邦大學生物醫(yī)學工程系的研究團隊通過建立早老癥細胞模型發(fā)現(xiàn)，表達早老蛋白或 ZMPSTE24 敲低的內皮細胞無法適應生理水平流體剪切應力，會出現(xiàn)細胞丟失，而特定抑制劑處理或預先讓細胞適應剪切應力可緩解這一情況。這表明內皮細胞因早老蛋白表達而無法適應流體剪切應力的機械力，可能是早老癥患者動脈粥樣硬化快速發(fā)生的重要原因。研究成果發(fā)表在Biomedical Journal期刊，題為“Progerin-expressing endothelial cells are unable to adapt to shear stress”。

首先，研究人員探討了早老蛋白表達對內皮細胞響應流體剪切應力的影響，發(fā)現(xiàn)表達早老蛋白或過表達野生型核纖層蛋白 A 的人臍靜脈內皮細胞，在12 dynes/cm² 剪切應力作用 72 小時后細胞數(shù)量顯著減少（圖 1A 和 B），蛋白質印跡法用于證實核纖層蛋白 A 和早老蛋白的過表達（圖 1C），而 24 小時時細胞損失極小，且靜態(tài)培養(yǎng)中無細胞損失，說明細胞損失并非快速發(fā)生，且依賴于流體剪切應力。同時，表達早老蛋白的細胞在剪切應力作用 24 小時后出現(xiàn)大量磷脂酰絲氨酸表面表達（圖 1D），這表明凋亡先于細胞損失發(fā)生。

圖1   早老蛋白的表達會導致 HUVECs 在層流剪切應力下發(fā)生細胞損失。

接著，研究人員通過 shRNA 敲低人臍靜脈內皮細胞中 ZMPSTE24 構建早老癥模型，發(fā)現(xiàn)該細胞 ZMPSTE24 含量減少 40%（圖 1G），出現(xiàn)核褶皺增多及剪切應力下細胞損失等類似早老癥的特征（圖 1E 和 F）。此外，將表達早老蛋白的細胞置于層流和振蕩剪切應力中，未發(fā)現(xiàn)不同流型導致細胞損失有顯著差異（圖 1H 和 I）。這些結果表明，核纖層蛋白 A 過表達或早老蛋白表達會影響內皮細胞對流體流動作用力的適應能力。

接下來，研究人員發(fā)現(xiàn)，表達早老蛋白的內皮細胞在流動和靜態(tài)條件下均存在核形態(tài)異常，這與早老癥細胞核纖層機械應力下重排能力降低相關。通過量化分析，表達早老蛋白的內皮細胞存在核纖層畸形（圖2A）、核向外囊泡（圖 2B）、微核（圖 2C）等核異常，且核纖層蛋白 B 結構被破壞，同時這些核異常在剪切應力（圖 2D）和靜態(tài)條件（圖 2E）下的發(fā)生水平相近，與非內皮細胞類型中的早老癥相關觀察結果一致。

圖2    層流剪切應力會導致表達早老蛋白的 HUVECs 出現(xiàn)核膜破壞。

表達早老蛋白的細胞因法尼基附著導致核膜葉狀化，而洛那法尼作為法尼基轉移酶抑制劑，可阻止早老蛋白積累并改善核形態(tài)。研究人員用洛那法尼處理 ZMPSTE24 敲低細胞和表達早老蛋白的內皮細胞后發(fā)現(xiàn)，其能顯著減少 ZMPSTE24 敲低細胞在剪切應力下的損失（圖 3A 和 B），但對表達早老蛋白的細胞損失無顯著改善。此外，其還可防止表達早老蛋白的細胞出現(xiàn)核膜破壞（圖 3C 和 D）。這表明洛那法尼能增強細胞對機械力變化的響應和適應能力。

圖3   洛那法尼可逆轉剪切應力下表達早老蛋白的 HUVECs 的細胞損失和核膜破壞。

表達早老蛋白的細胞存在組蛋白修飾異常，而藥物誘導異染色質增加可改善其核形態(tài)。研究人員用組蛋白三甲基去甲基化酶抑制劑甲基化抑制劑（methylstat）處理 ZMPSTE24 敲低及表達早老蛋白的內皮細胞后發(fā)現(xiàn)，在剪切應力作用下，這些細胞的損失（圖 4A 和 B）和核膜破壞均被阻止（圖 4C 和 D）。這表明，增加表達早老蛋白的內皮細胞的 DNA 甲基化水平，可逆轉其核形態(tài)并恢復對剪切應力的適應能力。

 圖4  甲基化抑制劑可逆轉剪切應力下表達早老蛋白的HUVECs 及 ZMPSTE24 敲低細胞的細胞損失。

最后，研究人員推測，無需經歷細胞和核形態(tài)變化的表達早老蛋白的內皮細胞受剪切應力影響更小。為了探究早老蛋白的表達會如何影響已排列的內皮細胞，研究人員通過將未轉導的內皮細胞暴露于剪切應力中 72 小時以誘導其排列 ，再轉導早老蛋白并繼續(xù)暴露于剪切應力72 小時。結果顯示，與未適應剪切應力的表達早老蛋白的細胞（圖 5B）相比，預先排列的細胞中表達早老蛋白（圖 5A）可減少細胞損失（圖 5C）并減少核膜破壞（圖 5D）。這些結果表明，表達早老蛋白的人臍靜脈內皮細胞預先排列可防止剪切應力下的細胞損失。

 圖5   表達早老蛋白的HUVECs 預先排列可防止剪切應力下的細胞損失。

總之，該研究表明，核纖層的變化（如早老蛋白表達、核纖層蛋白 A 過表達或 ZMPSTE24 缺失）會影響內皮細胞對流體剪切應力的正常適應能力，這可能是早老癥患者動脈粥樣硬化快速發(fā)生的重要原因，同時也凸顯了核纖層在內皮細胞機械適應中的關鍵作用。

參考文獻：Danielsson BE, Peters HC, Bathula K, Spear LM, Noll NA, Dahl KN, Conway DE. Progerin-expressing endothelial cells are unable to adapt to shear stress. Biophys J. 2022 Feb 15;121(4):620-628. doi: 10.1016/j.bpj.2022.01.004. Epub 2022 Jan 6. PMID: 34999130; PMCID: PMC8873939.
原文鏈接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC8873939/

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