細(xì)胞活力檢測(cè)方法盤(pán)點(diǎn)：MTT，CCK-8，ATP發(fā)光檢測(cè)法

 MTT 元老、CCK-8 新貴、ATP 實(shí)力派...誰(shuí)才是 C 位？ MCE 上新 ATP 發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒 (以下簡(jiǎn)稱 ATP 發(fā)光法)，簡(jiǎn)單、靈敏、快速的均質(zhì)檢測(cè)方法，堪稱細(xì)胞活力檢測(cè)的 "金標(biāo)準(zhǔn)"！

Section.01
細(xì)胞活力檢測(cè)大PK

常用的細(xì)胞活力檢測(cè)主要有 MTT、CCK8、Cell-ATP (CTG) 檢測(cè)法等。首先，我們先來(lái)簡(jiǎn)單看下這些檢測(cè)方法的原理、操作流程及優(yōu)缺點(diǎn)~

方法 1：MTT 法

MTT法：又稱 MTT 比色法。

原理

活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜 (Formazan) 并沉積在細(xì)胞中，但死細(xì)胞無(wú)此功能，后經(jīng) DMSO 溶解，于 490 nm 處測(cè)定吸光值便可間接反應(yīng)細(xì)胞活力。

流程
 

 
MTT 作為“元老”級(jí)別的檢測(cè)方法，雖然“老練”，Paper 無(wú)數(shù)，但麻煩是真麻煩。當(dāng)然，該方法除去操作步驟耗時(shí)以外，生成的 Formazan 是不溶于水的，需經(jīng) DMSO 溶解后才能檢測(cè)，增加了工作量的同時(shí)仍不能保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，且該溶劑對(duì)人體具有明顯毒性。

方法 2：CCK8 法

相較于 MTT，CCK8 法無(wú)論是操作步驟還是檢測(cè)時(shí)間都優(yōu)化了很多！

原理

CCK8 是一種基于 WST-8 而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度、無(wú)放射性的比色檢測(cè)方法(可看往期推文 CCK-8，讓細(xì)胞活性檢測(cè) So Easy!)。

流程

具體操作如下圖所示: 1) 96 孔板中每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要產(chǎn)生氣泡); 2) 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 1-4 h (避免放在培養(yǎng)箱邊緣位置); 3) 酶標(biāo)儀測(cè)定在 450 nm 處的吸光度。
 

 
案例

不同濃度 KN93 和 Gemcitabine 對(duì) CCLP1 cell 活力的影響

• 細(xì)胞系: CCLP1 cells 
• 培養(yǎng)條件: DMEM+10%FBS+1% amphotericin B/penicillin/streptomycin,1-2 h 后取樣檢測(cè) 
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: KN93 可增強(qiáng) Gemcitabine 對(duì) CCLP1 細(xì)胞的敏感性

圖 1. KN93 和 Gemcitabine 對(duì) CCLP1 細(xì)胞活力影響^[1]。
CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn) KN93 可以增強(qiáng) Gemcitabine 對(duì) CCLP1 的敏感性。

但在實(shí)驗(yàn)時(shí)，一直有個(gè)問(wèn)題讓人很困擾——“細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺”，但這個(gè)顏色深淺的標(biāo)準(zhǔn)我 “標(biāo)” 不出來(lái)怎么辦？痛點(diǎn)！痛點(diǎn)！痛點(diǎn)！

莫慌~試試 ATP 發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)！簡(jiǎn)單、靈敏、快速，反應(yīng) 10 分鐘即可得到“Bling Bling”的檢測(cè)結(jié)果，堪稱細(xì)胞活力檢測(cè)的"金標(biāo)準(zhǔn)"！

方法 3：ATP 發(fā)光法

ATP 發(fā)光法基于高靈敏度生物發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)對(duì)三磷酸腺苷 (ATP) 進(jìn)行定量以測(cè)定培養(yǎng)物中活細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞活力。

原理

熒光素酶以熒光素、三磷酸腺苷 (ATP) 和 O₂ 為底物，在 Mg²⁺ 存在時(shí)，可將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能。在熒光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)中，ATP 在一定的濃度范圍內(nèi)，其濃度與發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系。此方法不受化合物自發(fā)熒光的影響。

流程

具體操作如下：
1) 取出細(xì)胞培養(yǎng)板，室溫平衡 10 min;
2) 96 孔板中每孔直接加入 100 μL Cell-ATP 檢測(cè)試劑; 
3) 室溫振蕩混勻 2 min，以促進(jìn)細(xì)胞充分裂解; 
4) 室溫孵育 10 min (可根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整孵育時(shí)間)，使發(fā)光信號(hào)趨于穩(wěn)定; 
5) 使用具有檢測(cè)化學(xué)發(fā)光功能的多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測(cè)定 (檢測(cè)參數(shù)可根據(jù)儀器類型及檢測(cè)靈敏度適當(dāng)調(diào)整)。
 

 
該實(shí)驗(yàn)方法可用三個(gè)字簡(jiǎn)單概括 “快、準(zhǔn)、狠”，比 MTT 的處理速度快近 20 倍，節(jié)省時(shí)間近 4 小時(shí)。ATP 特有的均質(zhì)檢測(cè)法即 “加樣-混樣-檢測(cè)”，使用時(shí)，只需將本試劑等體積添加至培養(yǎng)細(xì)胞中即可進(jìn)行檢測(cè)。不用感慨，細(xì)胞活力檢測(cè)為什么不能如此簡(jiǎn)單？

表 1. MTT、CCK8 與 ATP 法特點(diǎn)比較
 

 
Section.02
ATP 發(fā)光法, 適用于哪些實(shí)驗(yàn)?

首先，ATP 作為細(xì)胞新陳代謝的一個(gè)重要指標(biāo)，與活細(xì)胞數(shù)目呈良好的線性關(guān)系，是細(xì)胞活力檢測(cè)的重要標(biāo)志性分子。

ATP 生物發(fā)光法的原理為：熒光素酶以熒光素、ATP 和 O₂ 為底物，在 Mg²⁺ 存在時(shí)，可將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能；在熒光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)中，ATP 在一定的濃度范圍內(nèi)，其濃度與發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，即在光信號(hào)與酶反應(yīng)體系中，發(fā)光值與 ATP 呈正比，ATP 與活細(xì)胞數(shù)成正比，ATP 發(fā)光法通過(guò) ATP 含量來(lái)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)或活力測(cè)定，且不受化合物自發(fā)熒光的影響 (圖 2)，是細(xì)胞增殖測(cè)定，細(xì)胞活力測(cè)定和細(xì)胞毒性高通量篩選分析的理想選擇。
 
圖 2. ATP 發(fā)光法檢測(cè)原理 

案例 1：細(xì)胞增殖測(cè)定

如圖 3 所示，為了探究 SIPL1 對(duì) TNBC 細(xì)胞增殖的影響，將 SIPL1 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至 BT-549 與 MDA-MB-231 細(xì)胞， 并使用 CCK8 法與 ATP 法，進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)。

• CCK-8 檢測(cè)：TNBC 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 shRNA 或過(guò)表達(dá)質(zhì)粒并培養(yǎng) 24 h 后檢測(cè)。
• ATP 發(fā)光細(xì)胞活力測(cè)定：TNBC 細(xì)胞在 37°C 下培養(yǎng)過(guò)夜。然后，將 100 μL ATP 發(fā)光法活力檢測(cè)試劑直接與培養(yǎng)基混合，在室溫下培養(yǎng) 20 分鐘。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染靶向 SIPL1 shRNAs 的 BT-549 和 MDA-MB-231 細(xì)胞系的細(xì)胞增殖顯著降低 (圖 3)。

圖 3. SIPL1 對(duì) TNBC 細(xì)胞活力的影響^[2]。
CCK-8 (a) 和 ATP 發(fā)光細(xì)胞活力測(cè)定 (b) 用指示載體轉(zhuǎn)導(dǎo) BT-549 和 MDA-MB-231 細(xì)胞增殖能力的分析。

案例 2：細(xì)胞活力測(cè)定

如圖 4 所示，為了探究外源 RRM2 是否會(huì)影響肝癌細(xì)胞的鐵死亡，在 HepG2 和 SMMC-7721 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或敲除 RRM2，通過(guò) ATP 發(fā)光法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞活力的影響。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá) RRM2 時(shí)，細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)，反之，敲除 RRM2 時(shí)，細(xì)胞活力明顯降低^[2]。
 
圖 4. 通過(guò) ATP 法測(cè)定 RRM2 對(duì)細(xì)胞活力的影響^[3]。
(a) 在體外表達(dá)或敲除 RRM2 的 HepG2 和 SMMC-7721 細(xì)胞中測(cè)量細(xì)胞死亡 (b) 和 4-HNE 水平 (c)，然后再用 Fer-1、ZVAD-FMK、Nec-1 或體外表達(dá)的 RRM2 進(jìn)行進(jìn)一步處理。細(xì)胞活力測(cè)定采用 ATP 發(fā)光細(xì)胞活力測(cè)定法。

案例 3：細(xì)胞毒性高通量篩選分析

如下圖所示，作者團(tuán)隊(duì)報(bào)告了一種基于濃度-反應(yīng)曲線的表型定量高通量篩選 (qHTS)，旨在識(shí)別對(duì)瘧原蟲(chóng)肝臟和無(wú)性血期寄生蟲(chóng)具有活性的化合物 (圖 5)。使用 SYBR Green 或熒光素酶來(lái)測(cè)試對(duì)寄生蟲(chóng)生長(zhǎng)的抑制，共檢測(cè)了 456,817 種化合物。

在 qHTS 之后，又分類選擇了 4,253 種合成易處理的化合物，用于驗(yàn)證抗瘧原蟲(chóng)活性和哺乳動(dòng)物毒性。在 3 μM 和 1 μM 濃度下對(duì)化合物進(jìn)行體外抗伯氏瘧原蟲(chóng)肝期寄生蟲(chóng)的評(píng)估。其中使用 ATP 發(fā)光法評(píng)估了所有 4,253 種化合物對(duì) HepG2 的細(xì)胞毒性。其中 255 種化合物對(duì) HepG2 細(xì)胞表現(xiàn)出一定程度的生長(zhǎng)細(xì)胞毒性，AC₅₀ 值 < 43 μM (隨后被排除)。最終篩選出 994 種經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的無(wú)毒性化合物，用于針對(duì)肝階段寄生蟲(chóng)的后續(xù)評(píng)估。
 
圖 5. 針對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)無(wú)性血期寄生蟲(chóng)的定量高通量篩選^[4]。

Section.03
ATP 發(fā)光法活力檢測(cè)
 


圖 6. MCE Cell-ATP Viability Detection Kit 與同類產(chǎn)品（競(jìng)品）對(duì)比測(cè)試結(jié)果。
a. 產(chǎn)品發(fā)光穩(wěn)定性測(cè)試（293T 細(xì)胞)；b. 不同細(xì)胞數(shù)的線性范圍比較 (293T 細(xì)胞)；c. 不同細(xì)胞系的檢測(cè)結(jié)果比較 (293T、H4IIE、Jurkat 細(xì)胞)

對(duì)比測(cè)試結(jié)果表明：持續(xù) 3 h 的生物發(fā)光穩(wěn)定性的檢測(cè)中，MCE Cell-ATP 檢測(cè)試劑 的發(fā)光信號(hào)值比較穩(wěn)定 (圖 6a)；不同細(xì)胞數(shù)的線性范圍中，MCE 產(chǎn)品線性關(guān)系良好，與進(jìn)口 競(jìng)品線性幾乎一致 (圖 6b)；且對(duì)于不同細(xì)胞系，MCE 產(chǎn)品與進(jìn)口競(jìng)品檢測(cè)信號(hào)值相當(dāng) (圖 6c)。綜上檢測(cè)結(jié)果表明，MCE ATP 發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、靈敏、批次間差異較小的不同細(xì)胞系的細(xì)胞活力檢測(cè)。

表 2. MCE Cell-ATP 檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品特性

 
靠譜的 ATP 發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑，尊貴的 VIP 客戶體驗(yàn)，想發(fā) SCI 深夢(mèng)囈語(yǔ)的心。無(wú)需按捺您的“蠢蠢欲動(dòng)”，MCE 官網(wǎng)可申領(lǐng)試用裝 (試用裝鏈接)。體驗(yàn)不收費(fèi)，時(shí)間最寶貴~ 快快申領(lǐng)吧！

實(shí)驗(yàn)小 Tips，附上 ATP 法使用注意事項(xiàng)，希望你能早日發(fā) SCI 啦。

1. 熒光素酶的活性對(duì)溫度較為敏感，反復(fù)凍融會(huì)致其逐漸失活，建議分裝凍存，避免反復(fù)凍融。凍融時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致試劑中出現(xiàn)少量沉淀，可平衡至室溫后觀測(cè)沉淀溶解情況，如仍有殘留，可離心后去除。
2. 本產(chǎn)品在使用或分裝時(shí)所使用耗材應(yīng)注意避免 ATP 污染。
3. 若待測(cè)藥物的溶劑含量較高，熒光素酶反應(yīng)可能會(huì)被干擾，致化學(xué)發(fā)光信號(hào)受到影響，可設(shè)置含有溶劑的細(xì)胞培養(yǎng)液的對(duì)照孔以排除此干擾。
4. 檢測(cè)時(shí)需使用適合于細(xì)胞培養(yǎng)的白色或黑色的多孔板 (96 孔板或 384 孔板)，普通透明多孔板的相鄰孔之間可能會(huì)產(chǎn)生相互干擾。如使用透明板，可使用不透明的白色膠帶粘貼孔底。
5. 建議在避光環(huán)境下進(jìn)行熒光檢測(cè)。
6. 由于整個(gè)發(fā)光反應(yīng)非常迅速，建議加入 ATP 發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑孵育 10 分鐘后，立即檢測(cè)熒光。
 

產(chǎn)品推薦

Cell Counting Kit-8 Cell Counting Kit-8，簡(jiǎn)稱 CCK-8 試劑盒或 CCK8 試劑盒，是一種基于 WST-8 而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性檢測(cè)的快速、高靈敏度試劑盒。

Cell-ATP Viability Detection Reagent MCE ATP 發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒基于高靈敏度生物發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)對(duì) ATP 進(jìn)行定量以測(cè)定培養(yǎng)物中活細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞活力。

Cytotoxicity LDH Assay Kit MCE LDH Assay Kit 是通過(guò)分析釋放到培養(yǎng)上清液中的 LDH 活性而測(cè)定細(xì)胞損傷的試劑盒。配合使用 CCK-8 (Cat.: No. HY-K0301) 可獲得死細(xì)胞、活細(xì)胞數(shù)據(jù)。

ATP 發(fā)光法 3D 細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒 ATP 發(fā)光法 3D 細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒基于高靈敏度生物發(fā)光檢測(cè)技術(shù) (熒光素酶系統(tǒng))，通過(guò)對(duì) ATP 進(jìn)行定量以測(cè)定培養(yǎng)物中 3D 細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞活力。?

 

[1] Fu Y, et al. Alpha5 nicotine acetylcholine receptor subunit promotes intrahepatic cholangiocarcinoma metastasis. Signal Transduct Target Ther. 2024 Mar 8;9(1):63.
[2] Juanjuan He, Jing Wang, et al. SIPL1, Regulated by MAZ, Promotes Tumor Progression and Predicts Poor Survival in Human Triple-Negative Breast Cancer. Front Oncol. 2021 Dec 17;11:766790. 
[3] Yueyue Yang, Jiafei Lin, Susu Guo, et al. RRM2 protects against ferroptosis and is a tumor biomarker for liver cancer. Cancer Cell Int. 2020 Dec 7;20(1):587.
[4] Dorjbal Dorjsuren, Richard T Eastman, et al. Chemoprotective antimalarials identified through quantitative high-throughput screening of Plasmodium blood and liver stage parasites.Sci Rep. 2021 Jan 22;11(1):2121.