文章分享：利用對(duì)Binder的結(jié)合界面增加組氨酸來讓其具有pH的敏感性

文章來源公眾號(hào)：生物快評(píng)           作者：sw

David Baker，2024諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的主，華盛頓大學(xué)教授

2025年9月29日David Baker，2024諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主發(fā)表了一篇《Computational design of pH-sensitive binders》，這篇文章利用對(duì)Binder的結(jié)合界面增加組氨酸來讓其具有pH的敏感性。

背后生化化學(xué)原理

氨基酸的結(jié)構(gòu)上，一端為氨基NH2，一端為COOH基團(tuán)，中間為一個(gè)CH，其中CH上為側(cè)鏈基團(tuán)，R基團(tuán)的差異就會(huì)導(dǎo)致氨基酸性質(zhì)的改變。那么根據(jù)R基團(tuán)的差異，可以將氨基酸分成4類：非極性氨基酸（就是不電離，不親水的氨基酸）；極性氨基酸（就是不帶電，但是親水的氨基酸）；堿性氨基酸（即在中性pH下帶正電的氨基酸）；酸性氨基酸（即在中性pH下帶負(fù)電的氨基酸）。

20種氨基酸分類表（4大類）

氨基酸的電解和電離常數(shù)pKa
因?yàn)榘被�酸同時(shí)具有酸性基團(tuán)COOH和堿性基團(tuán)NH2，且有些R基團(tuán)會(huì)額外電離，所以每個(gè)氨基酸的每個(gè)基團(tuán)都有自己的電離常數(shù)，pKa。pKa 是衡量一個(gè)酸強(qiáng)弱的定量指標(biāo)。

Ka 是這個(gè)解離反應(yīng)的平衡常數(shù)，其表達(dá)式為：

其中，[ ] 表示濃度。pKa值越小，酸性越強(qiáng)；pKa值越大，酸性越弱。

pKa 是Ka 的負(fù)常用對(duì)數(shù)：

氨基酸的電解，比如每個(gè)氨基酸都有電解常數(shù)1pKa1（COOH電解釋放H+的能力），NH2基團(tuán)的電解常數(shù)pKa2(即NH2釋放H+的能力)。其中有7個(gè)氨基酸的R基團(tuán)也能夠電離，所以他們額外有了pK_R（即R基團(tuán)電離釋放H+的能力）。

這7個(gè)氨基酸即3個(gè)堿性氨基酸Lysine\Argine\Histidine，2個(gè)酸性氨基酸aspartic acid和glutamic acid。

以及1個(gè)親水性的Cysteine，因?yàn)槠鋫?cè)鏈含有巰基（R-SH），該基團(tuán)在堿性環(huán)境中可作為質(zhì)子供體，失去質(zhì)子后形成硫醇陰離子（R-S⁻）；一個(gè)疏水性的Tyrosine（酪氨酸的酚羥基可發(fā)生去質(zhì)子化，該化學(xué)特性與苯酚（由苯環(huán)和氧原子構(gòu)成）類似，固有pKr）。

氨基酸的等電點(diǎn)
如剛才介紹的氨基酸的電離常數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)氨基端和羧基端和部分的R基團(tuán)都對(duì)氨基酸的整體電離有貢獻(xiàn)作用，此外氨基酸所處在的環(huán)境pH也會(huì)影響氨基酸的電離。溶液環(huán)境的pH值決定了這些基團(tuán)的解離狀態(tài)：

在低pH（酸性）環(huán)境中，溶液中的H⁺濃度高，會(huì)抑制羧基的解離，并促使氨基結(jié)合H⁺。因此，氨基酸整體帶正電荷。

在高pH（堿性）環(huán)境中，溶液中的OH⁻會(huì)中和H⁺，促使羧基解離釋放H⁺，同時(shí)氨基也難以結(jié)合H⁺。因此，氨基酸整體帶負(fù)電荷。

隨著pH值從低到高變化，氨基酸的凈電荷會(huì)從正電荷逐漸變?yōu)樨?fù)電荷。在這個(gè)變化過程中，必然存在一個(gè)特定的pH值，使得氨基酸的正負(fù)電荷數(shù)恰好相等，凈電荷為零。這個(gè)pH值就是該氨基酸的等電點(diǎn)（pI）。

如下圖給出了20個(gè)氨基酸的pKa和pI值。

pH和一些細(xì)胞內(nèi)吞過程有關(guān)系，比如新生兒Fc受體，FcRn

Biopolymers. 2017 Dec 21. doi: 10.1002/bip.23095.

新生兒Fc受體，是一種在整個(gè)生命體內(nèi)都發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)。它最初是在新生兒腸道中被發(fā)現(xiàn)的，負(fù)責(zé)吸收母體乳汁中的抗體（IgG），因此得名。FcRn的核心功能是延長(zhǎng)抗體（IgG）和白蛋白在體內(nèi)的壽命。其工作機(jī)制非常獨(dú)特，依賴于pH值的差異：

血液中的抗體（IgG）和白蛋白會(huì)被細(xì)胞通過“胞飲”作用隨機(jī)地吞進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，形成名為“內(nèi)體”的小泡。內(nèi)體內(nèi)的環(huán)境是酸性的（pH約6.0-6.5）。酸性環(huán)境下結(jié)合：在酸性條件下，F(xiàn)cRn受體的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，使其能夠與IgG或白蛋白的Fc段（恒定區(qū)）高親和力地結(jié)合。可以理解為，在酸性“房間”里，F(xiàn)cRn能“認(rèn)出”并“抓住”這些有用的分子。循環(huán)與釋放：沒有被FcRn結(jié)合的其它蛋白質(zhì)會(huì)被運(yùn)送到溶酶體中進(jìn)行降解。而被FcRn“抓住”的IgG和白蛋白則會(huì)被安全地運(yùn)輸回細(xì)胞表面。中性環(huán)境下釋放：當(dāng)這個(gè)載有FcRn和其“貨物”的小泡回到細(xì)胞表面時(shí)，會(huì)遇到血液中性的環(huán)境（pH約7.4）。在這個(gè)條件下，F(xiàn)cRn與IgG/白蛋白的親和力急劇下降，于是釋放它們回血液中。過程重復(fù)：這個(gè)循環(huán)過程周而復(fù)始，使得IgG和白蛋白在體內(nèi)的半衰期（存活時(shí)間）非常長(zhǎng)（IgG的半衰期約為21天）。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)目標(biāo)

蛋白設(shè)計(jì)的目標(biāo)，在蛋白質(zhì)靶向降解的情況下，比如溶酶體靶向降解（Lysosome targeting chimeras (LYTACs)，需要一個(gè)binder，一端結(jié)合目標(biāo)待降解分子，另一端靶向溶酶體循環(huán)受體（lysosome trafficking receptor (LTR)），這樣binder同時(shí)靶向LTR和目標(biāo)分子后，則會(huì)通過LTR內(nèi)吞進(jìn)入溶酶體將目標(biāo)分子降解。傳統(tǒng)的這類LYTAC技術(shù)沒有考慮在lysosome中與目標(biāo)分子的解離，導(dǎo)致了這類LYTAC binder分子在lysosome中也一同和目標(biāo)分子一起水解，這樣導(dǎo)致了LYTAC binder的使用量需要增加。

所以作者就想能不能設(shè)計(jì)一個(gè)LYTAC binder，和目標(biāo)分子在中性pH下結(jié)合能力強(qiáng)，在酸性pH環(huán)境下結(jié)合能力下降而與目標(biāo)分子解離。

那么怎么做到呢？

需要增加一些在pH酸性環(huán)境下，Binder的結(jié)合能力下降或者Binder自身的結(jié)構(gòu)改變了。組氨酸是唯一側(cè)鏈pKa值接近中性pH（~7.64）的氨基酸殘基，這使得它對(duì)生物體內(nèi)的pH梯度變化尤為敏感。循環(huán)系統(tǒng)中的pH值約為7.4，內(nèi)吞體中為5.0-6.0，而腫瘤微環(huán)境（TME）中為6.0-6.5。根據(jù)其質(zhì)子化狀態(tài)的不同，組氨酸既能接受也能提供與帶電殘基之間的氫鍵。當(dāng)環(huán)境pH低于其pKa值（約6.5）時(shí)，質(zhì)子化的組氨酸可作為兩個(gè)氫鍵的供體而非受體；而當(dāng)環(huán)境pH高于pKa值時(shí)，去質(zhì)子化的組氨酸既能作為一個(gè)氫鍵的供體，又能作為另一個(gè)氫鍵的受體——這第二個(gè)氫鍵在轉(zhuǎn)移至pH6的酸性環(huán)境時(shí)會(huì)被破壞。

作者首先整體隨機(jī)增加binder的His的比例，發(fā)現(xiàn)并沒有效果。隨后作者按照兩種思路進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：思路1是在binder與目標(biāo)分子結(jié)合的表面增加His，比如His在pH中性環(huán)境不影響binder結(jié)合目標(biāo)分子，而pH酸性條件下，His攜帶H+而影響了對(duì)目標(biāo)分子的結(jié)合，從而達(dá)到解離的效果（即interface destablization）。另一個(gè)思路就是在binder的內(nèi)部增加His，在酸性pH環(huán)境下binder中His攜帶同電荷的H+而排斥作用從而達(dá)到了與目標(biāo)分子的解離作用，這個(gè)思路的局限是需要這樣的binder分子較大，否則His會(huì)提前暴露。

比如靶向EpA2的binder，經(jīng)過interface destablization后，在pH=7.4下KD為678pM, 而在pH=5.4下，KD為15nM。所以EphA2 binder在酸性環(huán)境下親和力下降~20倍。

效果上，顯示pH-LYTAC在相同的劑量下可以靶向降解目標(biāo)分子EphA2的能力顯著增強(qiáng)（~90%降解），而常規(guī)LYTAC技術(shù)降解目標(biāo)分子效率只有~50%，原因在與pH-LYTAC可以循環(huán)利用。

這篇文章的核心生化原理并不復(fù)雜，難度是在于將His“裝飾”在binder的結(jié)合表面等，怎么保持不改變binder對(duì)目標(biāo)分子在pH=7.4下的結(jié)合能力。因?yàn)槲覀冎�道這種binder的“結(jié)合表面”改動(dòng)一個(gè)氨基酸都有可能改變binder的結(jié)合能力，甚至無法結(jié)合或者產(chǎn)生脫靶向能力。David baker實(shí)驗(yàn)室首先通過計(jì)算等辦法找到結(jié)合的表面或者binder的核心，然后通過噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行篩選確定有效的binder。

作者David Baker為2024年諾獎(jiǎng)得主，其實(shí)其導(dǎo)師，和導(dǎo)師的導(dǎo)師均獲得了諾獎(jiǎng)。見下：

David Baker于2024年因開發(fā)蛋白質(zhì)折疊RossetaFold榮獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

Randy Wayne Schekman是David baker的博士生導(dǎo)師，博士期間研究DNA聚合酶，個(gè)人獨(dú)立研究為囊泡運(yùn)輸，2013年謝克曼與詹姆斯·羅思曼和托馬斯·聚德霍夫因?yàn)樵诩?xì)胞膜囊泡運(yùn)輸方面有開創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)而共同獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

Randy Wayne Schekman的博士生導(dǎo)師是Arthur Kornberg(1918年3月3日—2007年10月26日），他研究研究DNA聚合酶而于1959年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。