STING固有免疫蛋白的信號(hào)通路、翻譯后修飾功能及WB檢測(cè)技巧
STING
作為固有免疫信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，STING廣泛表達(dá)于多種組織。STING的免疫調(diào)節(jié)作用使其成為腫瘤免疫治療領(lǐng)域的明星靶點(diǎn)，已在免疫學(xué)和病理學(xué)領(lǐng)域的研究取得了重要進(jìn)展。
大家在檢測(cè)STING蛋白時(shí)是不是也會(huì)得到與預(yù)期不符的結(jié)果呢？本篇文章總結(jié)了一些要點(diǎn)和大家一起探討，請(qǐng)和小優(yōu)細(xì)節(jié)君一起學(xué)習(xí)吧~
STING
干擾素基因刺激物(Stimulator of Interferon Genes，STING)通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)DNA結(jié)合，并在胞內(nèi)形成二聚體，從而激活下游信號(hào)通路，引發(fā)免疫細(xì)胞產(chǎn)生干擾素和其他免疫調(diào)節(jié)分子，以應(yīng)對(duì)病毒感染和其他病理狀態(tài)。
STING蛋白主要以對(duì)稱(chēng)二聚體形式存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。下圖以人 STING(hSTING) 蛋白為例，全長(zhǎng)由C末端結(jié)構(gòu)域(CTD)和跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)組成。CTD由配體結(jié)合域(LBD)或C末端尾部(CBD)和C末端尾部(CTT)組成，通常負(fù)責(zé)結(jié)合、蛋白質(zhì)相互作用和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TM結(jié)構(gòu)域，也稱(chēng)為N-末端區(qū)域，它在物種間是保守的，具有重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜支持作用。
cGAS-STING信號(hào)通路
cGAS-STING信號(hào)通路是一種經(jīng)典且重要的機(jī)體免疫應(yīng)答途徑。
cGAS（Cyclic GMP-AMP Synthase）是一種DNA感應(yīng)的酶，它與來(lái)自死細(xì)胞、病毒和細(xì)菌的DNA相互作用，在ATP和GTP存在的情況下催化合成二聚體的cGAMP（cyclic GMP-AMP），后者和細(xì)菌來(lái)源的環(huán)二核苷酸（CDNs）都可誘導(dǎo)STING的激活。
STING被激活后，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基體，在高爾基體區(qū)激活了TBK1和IKK，分別使IRF3和IκBα（NF-κB的抑制物）磷酸化。然后IRF3和IκBα二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，觸發(fā)了促炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯，如I型IFN、TNF和IL6，這些細(xì)胞因子可以參與抗病毒免疫應(yīng)答和自身免疫調(diào)控。
以上介紹了這么多STING，怎么樣才能在WB檢測(cè)中獲得理想的條帶呢？
01 確認(rèn)好的研究對(duì)象
雖然STING廣泛表達(dá)于多種組織類(lèi)型，包括免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞來(lái)源，但不代表每種細(xì)胞/組織都能檢測(cè)到STING的表達(dá)。因此，在選擇某種特定樣本進(jìn)行探究實(shí)驗(yàn)時(shí)，最好先查閱文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)看看是否有足夠的表達(dá)量，也可以同時(shí)使用表達(dá)量高的細(xì)胞樣本或者組織作為陽(yáng)性對(duì)照來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。THP-1細(xì)胞是經(jīng)典的cGAS-STING信號(hào)通路的工具細(xì)胞。
02 制樣時(shí)要超聲
如果樣本中STING的表達(dá)量不高，裂解細(xì)胞/組織時(shí)加以超聲，有助于斷裂染色質(zhì)，同時(shí)增加蛋白的可溶性，使抗原表位充分暴露出來(lái)，與抗體結(jié)合更容易。
超聲的方法也比較簡(jiǎn)單，細(xì)胞或組織裂解后，置于冰上，超聲條件是10-15s，3 次(期間每次間隔10s)，超聲頻率是30%－40%，電流30A; 如果沒(méi)有超聲儀，可以采用1ml 帶針頭的注射器冰上反復(fù)抽吸10-15 次替代，直到裂解液澄清好吸為止。
03 磷酸化檢測(cè)
外來(lái)核酸（如病毒DNA或細(xì)菌DNA）是STING信號(hào)通路激活的常見(jiàn)來(lái)源之一。當(dāng)然，細(xì)胞發(fā)生自發(fā)性的DNA損傷或某些細(xì)胞內(nèi)代謝異常時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA的釋放，從而激活STING。
在研究過(guò)程中應(yīng)該采用適當(dāng)?shù)奶幚項(xiàng)l件，如使用合適的激活劑（如cGAMP和DNA）以激活STING蛋白。此外，細(xì)胞的處理時(shí)間和劑量也需要進(jìn)行優(yōu)化，以確保適當(dāng)?shù)牧姿峄健?br />
要知道STING信號(hào)通路的蛋白表達(dá)情況在不同的細(xì)胞系中差距非常大，同樣的刺激方法在某些細(xì)胞中可以得到陽(yáng)性結(jié)果，換一個(gè)細(xì)胞系可能就不可行了。文獻(xiàn)中比較常見(jiàn)的工具細(xì)胞是RAW264.7細(xì)胞和小鼠骨髓源性的巨噬細(xì)胞。
CST推薦使用5 μg/mL poly(dA:dT)轉(zhuǎn)染3小時(shí)的條件處理細(xì)胞以獲得磷酸化STING的對(duì)照樣品。下圖為CST科學(xué)家使用同樣的刺激方法對(duì)不同表達(dá)STING的細(xì)胞系進(jìn)行刺激，然后檢測(cè)磷酸化STING的結(jié)果�？梢钥吹郊词雇瑯邮荢TING高表達(dá)的細(xì)胞，在poly(dA:dT)刺激下，STING的磷酸化水平也是不一樣的。
還有一點(diǎn)很容易被大家忽略：STING在磷酸化之后會(huì)出現(xiàn)條帶分子量上調(diào)的情況。在轉(zhuǎn)膜時(shí)就需要將膜留的寬一些，避免目的信號(hào)被裁去。
STING磷酸化上下游通路涉及到TBK1、IRF3、NF-κB等多個(gè)信號(hào)分子，相關(guān)靶標(biāo)的結(jié)果 也可以作為STING磷酸化表達(dá)的參考依據(jù)。
04 其他翻譯后修飾
除磷酸化外，STING還存在多種類(lèi)型的翻譯后修飾，包括多泛素化、SUMO化、棕櫚�；⑾趸榛�、氧化、羰基化和二硫鍵形成。這些修飾對(duì)STING的活化發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，如K48-多聚泛素化主要促進(jìn)STING經(jīng)蛋白酶體途徑的降解；K63-多聚泛素化可以促進(jìn)STING活化復(fù)合體的形成等。
下表詳細(xì)展示了STING翻譯后修飾的功能，大家在選擇研究方向和檢測(cè)位點(diǎn)時(shí)都可以參考~
以上是小優(yōu)細(xì)節(jié)君總結(jié)的一些關(guān)于STING的WB檢測(cè)Tips，當(dāng)您一直重復(fù)實(shí)驗(yàn)得不到理想結(jié)果時(shí)可以根據(jù)上述建議進(jìn)行調(diào)整嘗試，可能一個(gè)小細(xì)節(jié)的改變就可以幫您得到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
以下部分推薦產(chǎn)品助力您的實(shí)驗(yàn)：
作為固有免疫信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，STING廣泛表達(dá)于多種組織。STING的免疫調(diào)節(jié)作用使其成為腫瘤免疫治療領(lǐng)域的明星靶點(diǎn)，已在免疫學(xué)和病理學(xué)領(lǐng)域的研究取得了重要進(jìn)展。
大家在檢測(cè)STING蛋白時(shí)是不是也會(huì)得到與預(yù)期不符的結(jié)果呢？本篇文章總結(jié)了一些要點(diǎn)和大家一起探討，請(qǐng)和小優(yōu)細(xì)節(jié)君一起學(xué)習(xí)吧~
STING
干擾素基因刺激物(Stimulator of Interferon Genes，STING)通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)DNA結(jié)合，并在胞內(nèi)形成二聚體，從而激活下游信號(hào)通路，引發(fā)免疫細(xì)胞產(chǎn)生干擾素和其他免疫調(diào)節(jié)分子，以應(yīng)對(duì)病毒感染和其他病理狀態(tài)。
STING蛋白主要以對(duì)稱(chēng)二聚體形式存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。下圖以人 STING(hSTING) 蛋白為例，全長(zhǎng)由C末端結(jié)構(gòu)域(CTD)和跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)組成。CTD由配體結(jié)合域(LBD)或C末端尾部(CBD)和C末端尾部(CTT)組成，通常負(fù)責(zé)結(jié)合、蛋白質(zhì)相互作用和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TM結(jié)構(gòu)域，也稱(chēng)為N-末端區(qū)域，它在物種間是保守的，具有重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜支持作用。
圖1 hSTING功能域示意圖
cGAS-STING信號(hào)通路
cGAS-STING信號(hào)通路是一種經(jīng)典且重要的機(jī)體免疫應(yīng)答途徑。
圖2 cGAS-STING信號(hào)通路
cGAS（Cyclic GMP-AMP Synthase）是一種DNA感應(yīng)的酶，它與來(lái)自死細(xì)胞、病毒和細(xì)菌的DNA相互作用，在ATP和GTP存在的情況下催化合成二聚體的cGAMP（cyclic GMP-AMP），后者和細(xì)菌來(lái)源的環(huán)二核苷酸（CDNs）都可誘導(dǎo)STING的激活。
STING被激活后，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基體，在高爾基體區(qū)激活了TBK1和IKK，分別使IRF3和IκBα（NF-κB的抑制物）磷酸化。然后IRF3和IκBα二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，觸發(fā)了促炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯，如I型IFN、TNF和IL6，這些細(xì)胞因子可以參與抗病毒免疫應(yīng)答和自身免疫調(diào)控。
以上介紹了這么多STING，怎么樣才能在WB檢測(cè)中獲得理想的條帶呢？
01 確認(rèn)好的研究對(duì)象
雖然STING廣泛表達(dá)于多種組織類(lèi)型，包括免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞來(lái)源，但不代表每種細(xì)胞/組織都能檢測(cè)到STING的表達(dá)。因此，在選擇某種特定樣本進(jìn)行探究實(shí)驗(yàn)時(shí)，最好先查閱文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)看看是否有足夠的表達(dá)量，也可以同時(shí)使用表達(dá)量高的細(xì)胞樣本或者組織作為陽(yáng)性對(duì)照來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。THP-1細(xì)胞是經(jīng)典的cGAS-STING信號(hào)通路的工具細(xì)胞。
圖3 THE HUMAN PROTEIN ATLAS中STING在各種細(xì)胞系的表達(dá)量
圖4 STING (D2P2F) Rabbit mAb #13647 產(chǎn)品例圖
02 制樣時(shí)要超聲
如果樣本中STING的表達(dá)量不高，裂解細(xì)胞/組織時(shí)加以超聲，有助于斷裂染色質(zhì)，同時(shí)增加蛋白的可溶性，使抗原表位充分暴露出來(lái)，與抗體結(jié)合更容易。
超聲的方法也比較簡(jiǎn)單，細(xì)胞或組織裂解后，置于冰上，超聲條件是10-15s，3 次(期間每次間隔10s)，超聲頻率是30%－40%，電流30A; 如果沒(méi)有超聲儀，可以采用1ml 帶針頭的注射器冰上反復(fù)抽吸10-15 次替代，直到裂解液澄清好吸為止。
03 磷酸化檢測(cè)
外來(lái)核酸（如病毒DNA或細(xì)菌DNA）是STING信號(hào)通路激活的常見(jiàn)來(lái)源之一。當(dāng)然，細(xì)胞發(fā)生自發(fā)性的DNA損傷或某些細(xì)胞內(nèi)代謝異常時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA的釋放，從而激活STING。
在研究過(guò)程中應(yīng)該采用適當(dāng)?shù)奶幚項(xiàng)l件，如使用合適的激活劑（如cGAMP和DNA）以激活STING蛋白。此外，細(xì)胞的處理時(shí)間和劑量也需要進(jìn)行優(yōu)化，以確保適當(dāng)?shù)牧姿峄健?br />
要知道STING信號(hào)通路的蛋白表達(dá)情況在不同的細(xì)胞系中差距非常大，同樣的刺激方法在某些細(xì)胞中可以得到陽(yáng)性結(jié)果，換一個(gè)細(xì)胞系可能就不可行了。文獻(xiàn)中比較常見(jiàn)的工具細(xì)胞是RAW264.7細(xì)胞和小鼠骨髓源性的巨噬細(xì)胞。
CST推薦使用5 μg/mL poly(dA:dT)轉(zhuǎn)染3小時(shí)的條件處理細(xì)胞以獲得磷酸化STING的對(duì)照樣品。下圖為CST科學(xué)家使用同樣的刺激方法對(duì)不同表達(dá)STING的細(xì)胞系進(jìn)行刺激，然后檢測(cè)磷酸化STING的結(jié)果�？梢钥吹郊词雇瑯邮荢TING高表達(dá)的細(xì)胞，在poly(dA:dT)刺激下，STING的磷酸化水平也是不一樣的。
圖5 相同刺激方法在不同細(xì)胞中的作用效果
還有一點(diǎn)很容易被大家忽略：STING在磷酸化之后會(huì)出現(xiàn)條帶分子量上調(diào)的情況。在轉(zhuǎn)膜時(shí)就需要將膜留的寬一些，避免目的信號(hào)被裁去。
STING磷酸化上下游通路涉及到TBK1、IRF3、NF-κB等多個(gè)信號(hào)分子，相關(guān)靶標(biāo)的結(jié)果 也可以作為STING磷酸化表達(dá)的參考依據(jù)。
04 其他翻譯后修飾
除磷酸化外，STING還存在多種類(lèi)型的翻譯后修飾，包括多泛素化、SUMO化、棕櫚�；⑾趸榛�、氧化、羰基化和二硫鍵形成。這些修飾對(duì)STING的活化發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，如K48-多聚泛素化主要促進(jìn)STING經(jīng)蛋白酶體途徑的降解；K63-多聚泛素化可以促進(jìn)STING活化復(fù)合體的形成等。
下表詳細(xì)展示了STING翻譯后修飾的功能，大家在選擇研究方向和檢測(cè)位點(diǎn)時(shí)都可以參考~
圖6 STING 翻譯后修飾
以上是小優(yōu)細(xì)節(jié)君總結(jié)的一些關(guān)于STING的WB檢測(cè)Tips，當(dāng)您一直重復(fù)實(shí)驗(yàn)得不到理想結(jié)果時(shí)可以根據(jù)上述建議進(jìn)行調(diào)整嘗試，可能一個(gè)小細(xì)節(jié)的改變就可以幫您得到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
以下部分推薦產(chǎn)品助力您的實(shí)驗(yàn)：
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參考文獻(xiàn)：
1.Chen, Qi et al. “Regulation and function of the cGAS-STING pathway of cytosolic DNA sensing.” Nature immunology vol. 17,10 (2016): 1142-9. doi:10.1038/ni.3558
2.Decout, Alexiane et al. “The cGAS-STING pathway as a therapeutic target in inflammatory diseases.” Nature reviews. Immunology vol. 21,9 (2021): 548-569. doi:10.1038/s41577-021-00524-z
3.Zhang, Zili et al. “Multifaceted functions of STING in human health and disease: from molecular mechanism to targeted strategy.” Signal transduction and targeted therapy vol. 7,1 394. 23 Dec. 2022, doi:10.1038/s41392-022-01252-z
4.https://www.proteinatlas.org/ENSG00000184584-STING1
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