細(xì)胞焦亡的研究方法和關(guān)鍵調(diào)控因子

1. 借助掃描電鏡直觀觀察細(xì)胞形態(tài)，判斷是否出現(xiàn)細(xì)胞焦亡特有的腫脹、細(xì)胞膜穿孔等典型形態(tài)特征；
2. 通過 TUNEL 染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) DNA 片段化情況，輔助鑒別細(xì)胞死亡是否伴隨焦亡相關(guān)的核酸損傷特征；
3. 采用免疫熒光染色技術(shù)（LabEx可提供檢測(cè)服務(wù)），針對(duì) GSDMD 或 GSDME 蛋白進(jìn)行標(biāo)記，觀察其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位，明確焦亡關(guān)鍵效應(yīng)蛋白的激活與分布狀態(tài)。

（2）焦亡相關(guān)蛋白檢測(cè)

1. 采用 qPCR 技術(shù)或 Western Blot 技術(shù)，分別從基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平，檢測(cè)與細(xì)胞焦亡相關(guān)的基因或蛋白的表達(dá)量，以此判斷焦亡通路是否被激活，LabEx提供升級(jí)版wb=抗體芯片技術(shù)，可一次性檢測(cè)幾十個(gè)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白；
2. 通過 ELISA 試劑盒特異性捕獲樣本中的 IL-1β、IL-18 等炎癥因子，定量檢測(cè)其水平變化，為細(xì)胞焦亡過程中炎癥反應(yīng)的激活提供直接依據(jù)，LabEx提供Luminex、MSD等多因子檢測(cè)技術(shù)，可在一份樣本中檢測(cè)十幾、幾十種關(guān)鍵因子指標(biāo)；
3. 利用 MTT 法或 CCK-8 法，通過檢測(cè)細(xì)胞對(duì)試劑的代謝活性，間接測(cè)定細(xì)胞活力，輔助判斷細(xì)胞是否因焦亡發(fā)生死亡及死亡程度。

3、細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵調(diào)控分子有哪些？
（1）GSDMs
Gasdermins（GSDMs）蛋白是介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵效應(yīng)分子，目前已知人類 GSDM 基因家族包含 6 個(gè)成員，分別為 GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME 與 DFNB59。在這 6 個(gè)成員中，除 DFNB59 外，其余所有 GSDMs 蛋白均由兩個(gè)功能不同的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：一是 C 末端抑制結(jié)構(gòu)域（Regulatory Domain, RD，簡稱 CT），二是 N 末端效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（Pore-Forming Domain, PFD，簡稱 NT），其中 NT 結(jié)構(gòu)域具備細(xì)胞毒性。當(dāng) RD 結(jié)構(gòu)域被水解去除后，游離的 PFD 結(jié)構(gòu)域可與細(xì)胞膜上的脂質(zhì)組分結(jié)合，進(jìn)而在細(xì)胞膜上形成孔洞，啟動(dòng)細(xì)胞焦亡過程。

   

現(xiàn)階段，GSDMs 家族中僅 GSDMD 誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的機(jī)制已明確，這也是公認(rèn)的細(xì)胞焦亡經(jīng)典途徑。其具體過程為：當(dāng)細(xì)菌、病毒等信號(hào)作用于細(xì)胞時(shí)，胞內(nèi)模式識(shí)別受體（NLR）識(shí)別信號(hào)后，通過接頭蛋白 ASC 與 caspase-1 前體結(jié)合形成多蛋白復(fù)合物，激活 caspase-1；活化的 caspase-1 一方面切割 GSDMD 產(chǎn)生 GSDM-NT 活性肽段，誘導(dǎo)細(xì)胞膜穿孔、細(xì)胞破裂并釋放內(nèi)容物以觸發(fā)炎癥，另一方面切割 IL-1β、IL-18 前體生成活性形式，釋放后募集炎癥細(xì)胞擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。

但研究發(fā)現(xiàn)存在例外情況：巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中，部分細(xì)胞在炎性小體激活導(dǎo)致 GSDMD 裂解后，并未發(fā)生膜破裂與焦亡，反而能夠存活，這類細(xì)胞被定義為 “超活化細(xì)胞”。由于超活化細(xì)胞可分泌更多炎性介質(zhì)，而乳酸脫氫酶（LDH）的釋放量與細(xì)胞膜完整性相關(guān)（焦亡細(xì)胞膜破裂會(huì)釋放大量 LDH，超活化細(xì)胞則不會(huì)），因此可通過檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中 LDH 的水平，區(qū)分細(xì)胞是超活化狀態(tài)還是發(fā)生了焦亡。然而，當(dāng)前對(duì)于 GSDMD 裂解后為何會(huì)分別引發(fā)焦亡或超活化的具體調(diào)控機(jī)制，尚未得出明確結(jié)論。

參考文獻(xiàn)：Channelling inflammation: gasdermins in physiology and disease.  2021 May;20(5):384-405. 

  

（2）Caspase-1

作為 IL-1β 轉(zhuǎn)化酶（IL-1β converting enzyme），caspase-1 是由單核細(xì)胞合成的蛋白酶，其核心功能是介導(dǎo) 34kD 的 IL-1β 前體（pro-IL-1β）向 17kD 成熟 IL-1β 的剪切，且這一加工過程對(duì) IL-1β 活性的發(fā)揮至關(guān)重要。具體表現(xiàn)為：不表達(dá) caspase-1 的細(xì)胞系，在轉(zhuǎn)入 IL-1β 基因后僅能產(chǎn)生 pro-IL-1β，無法分泌有活性的成熟 IL-1β；而 caspase-1 特異性抑制劑可成功阻斷金黃色葡萄球菌刺激引起的 IL-1β 分泌。酶學(xué)特征方面，caspase-1 屬于半胱氨酸蛋白酶，活性中心含高活性巰基，對(duì)氧化劑敏感，但不會(huì)被絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶的抑制劑所抑制。 

 

（3）NLRP3

炎癥小體是細(xì)胞內(nèi)的蛋白復(fù)合物，機(jī)體受刺激后，可在免疫細(xì)胞及非免疫細(xì)胞中出現(xiàn)。NOD 樣受體（NOD-like receptor，NLR）相關(guān)炎癥小體是人體固有免疫的重要組成部分，功能關(guān)鍵。NLR 家族的分類依據(jù)是炎癥小體氨基末端的結(jié)構(gòu)特征：含吡啶結(jié)構(gòu)域（PYD）或半胱天冬酶激活和募集結(jié)構(gòu)域（CARD），據(jù)此可分為 NLRP、NLRC 等亞家族。而由 NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白 3（NLRP3）構(gòu)成的炎癥小體，即為 NLRP3 炎癥小體。

 

NLRP3 炎癥小體的結(jié)構(gòu)由三部分核心組件構(gòu)成，分別是 NLRP3 蛋白、凋亡相關(guān)點(diǎn)樣蛋白（apoptosis associated speck-like protein containing a CARD domain，簡稱 ASC），以及前半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 1（pro-caspase-1）。

人類 NLRP3 轉(zhuǎn)錄基因 cias1 定位于 1q44 號(hào)染色體；ASC 蛋白由 N 端熱蛋白結(jié)構(gòu)域與 C 端半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域（CARD）構(gòu)成，其中 N 端可結(jié)合 NLRP3 受體蛋白，C 端能募集兩個(gè) pro-caspase-1 分子。NLRP3 炎癥小體可被模式識(shí)別受體（PRR）激活，激活信號(hào)包括病原相關(guān)分子模式（PAMP）與危險(xiǎn)相關(guān)分子模式（DAMP）。
 

經(jīng)典激活途徑中，NLRP3 在激酶 NEK7 作用下發(fā)生復(fù)合物分離，進(jìn)而誘導(dǎo) caspase-1 自動(dòng)激活，隨后在 NF-κB 參與下，proIL-1β 與 proIL-18 被切割激活；非經(jīng)典途徑則依賴 caspase-4、5、11，最終生成具生物活性的 IL-1β 與 IL-18。近期研究表明，兩種途徑中 GSDMD（gasdermin D）蛋白均起關(guān)鍵作用：它可誘導(dǎo)細(xì)胞膜穿孔，促進(jìn) IL-1β 與 IL-18 從胞質(zhì)釋放，同時(shí)也是細(xì)胞焦亡的核心蛋白。