文章解讀：in vivo CAR-T療法中VivoVec慢病毒遞送系統(tǒng)的研究

文章來源公眾號：落花微雨的知識樹 作者：心字疊衣

最近，in vivo CAR-T療法無疑成為了生物醫(yī)學領域最炙手可熱的話題！從學術會議到投資論壇，從科研論文到媒體報道，這股熱潮幾乎席卷了整個生命科學界。網(wǎng)絡上關于這項技術的討論呈現(xiàn)出明顯的兩極分化——支持者視其為癌癥治療的終極解決方案，質疑者則對其安全性和商業(yè)化前景持保留態(tài)度。但無論爭議如何，in vivo CAR-T療法的迅猛發(fā)展本身就說明了其巨大的潛力和價值。

作為科研工作者，我們更需要透過現(xiàn)象看本質。與其被外界的喧囂所干擾，不如靜下心來深入研讀幾篇高質量的文獻，從基礎機制到臨床數(shù)據(jù)，從技術瓶頸到未來方向，真正理解這項技術的核心所在。今天，就讓我們一起開啟這場in vivo CAR-T的文獻探索之旅！

這是2024年8月份發(fā)表在blood的一篇文章：In vivo CAR T-cell generation in nonhuman primates using lentiviral vectors displaying a multidomain fusion ligand. 雖然這不是最新的文獻，但是VivoVec是Umoja Biopharma開發(fā)的慢病毒遞送系統(tǒng)，所以這篇文獻還是值得學習一下的。說起來，這是解讀的第二篇，第一篇詳見：文獻閱讀[1]-CAR T cells produced in vivo to treat cardiac injury

01：文章前言
文章里作者提到了目前普通CAR-T制備的問題：一個主要的問題制備復雜，需要從每個患者身上收集大量的T細胞，將細胞運送到專門的制造中心，通過進行體外基因編輯和T細胞擴增，將其制備成最終的產品，期間需要進行QC，最終才能將CAR-T細胞產品回輸。這一過程導致了在初始T細胞收集和最終產品回輸之間存在大量的等待期。此外，CAR-T回輸前也需要進行清淋，而且有時候伴隨著較大的毒性，需要住院治療。目前CAR-T細胞的制備和給藥過程的復雜性，以及高昂的成本使得只有一小部分符合條件的患者可以獲得CAR-T細胞治療。

基于此，作者開發(fā)了VivoVec系統(tǒng)：
基礎載體類型：是第三代自失活慢病毒載體。這類載體經(jīng)過基因工程改造，刪除病毒復制所需基因，且啟動子區(qū)域具有自失活設計，可降低插入突變風險，符合臨床安全性要求。

表面展示的功能元件：
1）載體表面展示抗CD3單鏈可變片段。該scFv是人工設計的抗體片段，能特異性結合T細胞表面的CD3分子，實現(xiàn)載體對T細胞的靶向性結合。

2）偽型化包膜蛋白：載體采用低密度脂蛋白受體趨向性的cocal融合糖蛋白進行偽型化：cocal糖蛋白是囊泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)的結構類似物，但具有更強的生物學特性：抗血清滅活能力，相比傳統(tǒng)VSV-G包膜，cocal蛋白能抵抗人體補體系統(tǒng)的中和作用，確保載體在體內循環(huán)時保持穩(wěn)定，避免被快速清除。病毒的cocal通過與細胞表面的LDLR識別，從而將CAR基因傳遞到T細胞內。

3）同時表達CD80和CD58共刺激配體；

02：文章正文
2.1 VVPs displaying CD80 and CD58 generate greater numbers of CAR T cells with increased in vitro and in vivo antitumor functionality.
抗原遞呈細胞同時向T細胞提供peptide-MHC抗原呈遞和共刺激信號，從而使得T細胞活化。這些信號對于確保T細胞激活，促進分化，獲得效應功能和形成長期記憶至關重要。CD28和CD2，以及它們各自的配體CD80和CD58，是構成T細胞-抗原提呈細胞的關鍵共刺激信號。作者猜測，在先前展示抗CD3 scFv的VVPs中加入CD80和CD58共刺激配體，將增強其激活T細胞的能力，從而產生具有改善抗腫瘤功能的CAR T細胞。為了驗證這一假設，作者構建了VVPs和共表達CD80和CD58的VVPs，并在體外培養(yǎng)的健康人PBMCs中評估2種共刺激配體的作用（S1A-B）。不同于典型的使用抗CD3/CD28磁珠刺激的體外制備CAR-T細胞的方案，VVPs直接添加到PBMCs中，而不需要任何外源性刺激。共刺激分子的加入大大增強了病毒顆粒結合T細胞的能力（S1C）。

而且共刺激分子的加入也導致短期T細胞活化增強，這里是VVPs加入三天后，通過流式檢測CD25的表達水平驗證的（1A）。

而且共刺激分子的加入也導致T細胞釋放了更多的細胞因子，包括IFNγ，IL-2和TNF-α（S1D）。

不論是否含共刺激配體的VVPs都能產生相似比例的CAR-T細胞（S1E）。

但是有共刺激配體的VVPs可以產生更多的CAR-T細胞（1B）。

表型上，表達共刺激分子的VVPs產生的CAR-T細胞表面表達更多的CCR7和CD27（S1F）。這兩個marker是記憶性T細胞群相關的標志物，與體外CAR-T細胞治療的臨床反應呈正相關�？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明，含有CD80和CD58共刺激配體的VVPs表現(xiàn)出增加的T細胞結合和激活，從而導致更多的CAR-T細胞生成，并具有較低分化的T細胞表型。

將表達或不表達共刺激分子的VVPs產生的CAR-T細胞分別與Nalm-6細胞以不同的ET比共培養(yǎng)，24小時后，檢測細胞因子的表達。表達共刺激分子的VVPs組的CAR-T細胞比單獨表達抗CD3 scFv的VVPs產生的IFNγ的量相似，但IL2和TNF-α的水平更高（1C）。

表達共刺激分子的VVPs組的CAR-T細胞與Nalm-6細胞共培養(yǎng)后，CAR-T細胞擴增的也更多。這里是由CellTrace dilution來判斷的。從圖中可以看到，Costim組的CellTrace的熒光都偏弱，說明這個組的CAR-T細胞擴增更強，造成CellTrace Dye被稀釋（S1G）。

將VivoVec生成的抗CD19 CAR-T細胞（分兩組：含共刺激分子CD80/CD58的VVPs vs. 僅含anti-CD3 scFv的VVPs）與表達CD19的腫瘤細胞（Nalm6）共培養(yǎng)。每2-4天移除舊培養(yǎng)基，重新添加新鮮腫瘤細胞（圖中箭頭表示刺激時間點），持續(xù)監(jiān)測腫瘤細胞數(shù)量變化（通過熒光標記定量）。含共刺激分子的VVPs組的CAR-T細胞持續(xù)抑制腫瘤生長，即使在多次刺激后仍能有效控制腫瘤細胞數(shù)量（圖中藍色曲線維持低位）。僅含anti-CD3 scFv的VVPs組，隨刺激次數(shù)增加，腫瘤細胞逐漸增殖（紅色曲線上升），表明CAR-T細胞功能衰竭或持久性不足（1D）。

雌性Nod.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ小鼠（這個小鼠重度免疫缺陷導致T/B細胞缺失；IL2rg基因敲除缺乏NK細胞；MHC I/II雙敲除）。Day -4，通過 尾靜脈注射 2.5E5個 Nalm6細胞。Day -1，用 IVIS測量小鼠腫瘤負荷。根據(jù)腫瘤大小隨機分組，確保組間基線一致。通過腹腔注射2E7個PBMCs。Day 0，腹腔注射攜帶CAR基因的 VivoVec病毒顆粒（劑量根據(jù)分組調整），體積200 μL（S1E）。

VVP給藥4天后，取小鼠的外周血，通過流式細胞術定量分析人源CD3+ T細胞表面CD25和CD71的表達水平，評估其活化狀態(tài)。1E的橫坐標代表的是不同VivoVec病毒顆粒的注射劑量，單位為轉導單位（TU）。與體外研究結果一致，表達帶有共刺激配體的抗CD3 scFv的VVPs比單獨表達抗CD3 scFv的VVPs誘導了更強的T細胞活化，且呈劑量依賴性。VVP給藥11天后檢測外周血中CAR-T細胞頻率。用含共刺激配體的抗CD3 scFv的VVPs處理的動物顯示出更多的CAR-T細胞數(shù)量（1F-G）。最后，對腫瘤負荷進行評估，使用共刺激配體表達抗CD3 scFv的VVPs治療，在VivoVec病毒顆粒較低劑量下腫瘤抑制作用就很強了（1H）。

2.2 An MDF protein comprising costimulatory molecules enhances T-cell activation and transduction.
作者設計了一種包含多個結構域的蛋白（MDF）：包括CD58、抗CD3 scFv和CD80組成的單鏈長肽。這樣可以簡化VVPs的制備，并且成功將MDF成功展示在病毒表面（S2A）。

出乎意料的是，與單獨的抗CD3 scFv或含有共刺激分子的病毒顆粒相比，MDF VVPs與T細胞的結合要更多（2A），并導致更高的T細胞CD25表達（2B）。

但是MDF VVPs病毒顆粒誘導的細胞因子并沒有明顯增加（S2B）。

值得注意的是，MDF VVPs在體外能更有效地產生CAR-T細胞，尤其是在低感染復數(shù)時(2C)。

與含有共刺激分子的病毒顆粒相比，MDF VVPs制備的CAR-T細胞表面表達相當?shù)腃CR7和CD27記憶細胞標志物（S2C）。

接下來就是，與表達共刺激分子的VVPs組相比，MDF VVP產生的抗CD19 CAR-T細胞在與Nalm6細胞共培養(yǎng)時，CAR-T細胞擴增的量差不多（2E），IFNγ產生量差不多（2D），但產生更多的IL-2和TNF-α（2D），提示MDF VVP產生的CAR-T細胞可能具有更好的功能性。在連續(xù)刺激實驗中，MDF VVP產生的CAR-T細胞能夠更好地控制Nalm6腫瘤的生長（2F）。

在連續(xù)刺激實驗中，MDF VVP產生的CAR-T細胞甚至優(yōu)于使用傳統(tǒng)的CD3/CD28 beads為基礎的刺激方案產生的CAR-T細胞(S2D)。

2.3 MDF VVPs exhibit enhanced in vivo functionality in a humanized mouse leukemia model.
作者再次使用NSG MHC I/II KO模型驗證MDF VVP的抗腫瘤作用。 VVP給藥4天后，取小鼠的外周血，通過流式細胞術定量分析人源CD3+ T細胞表面CD25和CD71的表達水平，評估其活化狀態(tài)。與體外研究結果一致，MDF VVPs比表達共刺激的VVPs誘導了更強的T細胞活化，且呈劑量依賴性（3A）。VVP給藥11天后，作者觀察到兩種病毒顆粒在血液中產生了相似比例的CAR-T細胞，但MDF VVPs病毒顆粒可以產生更多的CAR-T細胞數(shù)目（3B）。這里與Figure1相比，3B中CAR-T細胞的數(shù)目明顯少了很多，作者給出的解釋是因為不同donor不一樣的原因。

雖然兩種病毒顆粒均能控制腫瘤生長，但MDF VVPs在控制腫瘤生長和總生存期方面表現(xiàn)略好。

這在10E6個轉導單位的較低劑量時尤為明顯，MDF VVPs治療動物的中位生存期為90.5天，而表達共刺激分子的病毒顆粒組的中位生存期為62天（3D）。值得注意的是，在50E6個轉導單位的較高劑量下，MDF VVP處理的動物在研究期間達到了100%的存活率。這些數(shù)據(jù)表明，在這個模型中，展示MDF蛋白的VVPs相對于表達抗CD3 scFv和表達共刺激配體的VVPs具有更好的抗腫瘤效果。

2.4 MDF VVPs administered intranodally induce potent and prolonged B-cell depletion in NHPs.

人源化小鼠模型具有局限性，并不能完全再現(xiàn)動物免疫系統(tǒng)的完整程度，特別是完全缺乏正常發(fā)育的次級淋巴組織和對異種移植物抗宿主病的易感性。為了解決這些局限性，作者在M nemestrina中開發(fā)了一個NHP模型，因為該物種允許用HIV-1衍生的慢病毒載體轉導。在這個模型中，作者使用了一種NHP/人交叉反應的抗CD20 CAR，此前已經(jīng)證明在恒河猴體內使用體外制造的CAR-T細胞可以消除B細胞。為了使MDF蛋白適用于該模型，作者將抗人CD3 scFv替換為抗NHP CD3 scFv。人的CD58和CD80保留下來，因為這兩種蛋白在這兩個物種中的序列具有高度同源性（S3A）。

評估MDF VVPs的NHP替代物對M.nemestrina CD4和CD8 T細胞的結合、激活和轉導進行體外驗證（S3B）。與靶細胞LLC-MK2-NLO+/-CD20共培養(yǎng)，驗證CAR-T細胞的細胞殺傷功能（S3C）�？偟膩碚f，這些結果表明，NHP MDF VVPs結合、激活和轉導NHP T細胞的能力與人MDF VVPs相當。

NHP模型：簡言之，通過淋巴結注射，將攜帶抗CD20 CAR負載的NHP MDF VVPs以不同劑量注射到4只動物的淋巴管系統(tǒng)。與靜脈給藥途徑相比，選擇淋巴結給藥途徑可以實現(xiàn)有效的病毒顆粒與T細胞相互作用，同時減少全身組織對游離病毒顆粒的暴露。動物每周取血1-2次，通過流式細胞術檢測病毒顆粒誘導的T細胞活化、CAR表達和隨后的B細胞耗竭。同時對動物進行CRS和ICANS體征監(jiān)測。在這個實驗中，作者既沒有清淋，也沒有額外補充細胞因子。其中，1只動物(Z20020)接受了低劑量的VVPs（原劑量的五分之一）。

給藥后7天，4只動物中有3只觀察到NHP MDF VVP誘導的T細胞活化（4A）。在這3只動物中，NHP MDF VVP給藥效果顯著，在第10天產生的CAR T細胞占循環(huán)T細胞的比例高達65% (4B)，相當于每微升血液中含有5963875和11182個CAR-T細胞。低劑量組的Z20020, 作者沒有觀察到明顯的T細胞活化，CAR的表達，也沒有觀察到B細胞的消除。

正如預期的那樣，到第7天，在所有檢測到CAR-T細胞的動物中，循環(huán)B細胞都檢測不到了。說明CAR-T細胞大量產生與B細胞消除是同時出現(xiàn)的（4C-D）。相比之下，在產生CAR-T細胞的3只動物中，循環(huán)B細胞的丟失是一致的，也非常持久。在治療后的第56、63和76天，循環(huán)B細胞幾乎檢測不到（Z19051稍微差一點，B細胞在63和76還是能看到一點B細胞）。值得注意的是，1只動物( Z20106 )在第49天顯示出大量的血液CAR T細胞的重新擴增，以應對在研究的第42天明顯的少量B細胞的再次出現(xiàn)。這表明VivoVec產生的CAR-T細胞具有持久性，這預示著記憶性CAR-T細胞的產生。與記憶性T細胞的形成一致，B細胞也在第二只動物的第43天( Z19078 )的循環(huán)中重新出現(xiàn)，然后在第49天再次丟失。直到第63天，B細胞在該動物中仍然檢測不到，這表明抗原特異性記憶CAR-T細胞功能持續(xù)存在。

在CRS方面，作者在血液(S3E)中檢測到，CAR-T細胞產生的前不久就會觀察到C反應蛋白(CRP)水平升高，這表明這是CAR-T細胞介導的，而不是病毒顆粒導致的。這是短暫的，隨著CAR-T細胞在第14天從血液中消失，CRP水平正�；�。如上所述，1只動物在第49天經(jīng)歷了血液CAR-T細胞的回升(4C)，這也再次伴隨著CRP的短暫升高。IL-6，鐵蛋白和溫度遵循類似的規(guī)律。除了CRS癥狀，作者在前2只動物中觀察到輕微的震顫和短暫的癲癇。這些事件是短暫的，與第10天觀察到的CAR-T細胞擴增峰值相吻合。給予托珠單抗和阿那白滯素治療后震顫消失。作者沒有觀察到任何明顯的肝臟毒性的跡象，與谷丙轉氨酶，谷草轉氨酶，堿性磷酸酶仍然保持在正常水平，除1只動物的谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶在第1天出現(xiàn)短暫輕度升高外（S3F）。

取VVP治療最長時間(139天)的1只動物進行剖檢，20種不同組織通過ddPCR評估載體基因組整合。在注射的部位inguinal lymph node和緊接著的medial iliac lymph node可以檢測到抗CD20 CAR轉基因。但是在其它組織中并沒有檢測到，這表明在VivoVec處理后，轉基因細胞主要被隔離在注射和鄰近的淋巴結中幾個月（4E）。

作者通過RNA ISH檢測了CAR基因的生物分布（S3G）。與ddPCR數(shù)據(jù)一致，作者在注射的部位inguinal lymph node和緊接著的medial iliac lymph node可以檢測到極少數(shù)細胞中CAR的表達。還在脾臟、骨髓和肺中檢測到低水平的信號，作者認為這些信號是CAR+細胞向這些部位轉運的標志。此外別的組織內依然檢測不到�？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明，VivoVec通過淋巴內注射，在沒有清淋的情況下，可以在免疫健全的NHP中有效地生成CAR-T細胞。生成的CAR-T細胞功能強大，導致B細胞清除長達76天。

03：方法參考
3.1 Vector production：
將5種質粒同時轉入懸浮培養(yǎng)的HEK 293T細胞：gag pol(編碼病毒結構蛋白（衣殼、酶等）); rev(協(xié)助病毒RNA轉運出細胞核); cocal(編碼低密度脂蛋白受體嗜性的病毒包膜糖蛋白（替代VSV-G）); MDF(編碼多域融合蛋白); payload(攜帶目標CAR轉基因, 如抗CD20 CAR)。轉染16小時后加入含15 U/mL Denarase（一種核酸酶）的新鮮培養(yǎng)基，降解殘留DNA/RNA以降低粘度并提高載體純度。次日收獲上清，用陰離子交換層析（Mustang Q色譜柱）初步純化，通過切向流過濾濃縮并置換緩沖液，通過0.2 μm PES濾膜除菌過濾，最后分裝冷凍最終病毒載體產品（VVPs）。
3.2 Particle binding： 
PBMCs與病毒顆粒在室溫下共培養(yǎng)1-4 h，每毫升病毒對應2E7個細胞，感染復數(shù)（也就是MOI）為2-10。使用anti-cocal antibody通過流式評估病毒顆粒/T細胞結合。這里的cocal是表達在VVPs病毒顆粒表面的糖蛋白，病毒顆粒與細胞共孵育后短時間內（1-4小時）進行的檢測。這個時間點主要發(fā)生的是病毒顆粒與細胞表面的特異性結合（通過MDF蛋白），還來不及發(fā)生高效的病毒轉導和細胞內基因表達。此時檢測到的cocal信號幾乎完全來源于附著在T細胞表面的完整病毒顆粒上的cocal包膜糖蛋白，并非來源于T細胞內部表達或產生的cocal蛋白（T細胞本身不表達cocal）。
3.3 In vitro PBMC transduction：
病毒顆粒直接加入到PBMCs中，按照每毫升對應2E6個PNMCs細胞。分別在第3天和第7天用流式檢測激活和轉導情況。
3.4 In vitro PBMC transduction： 
取5E4個CAR-T細胞，使用CellTrace Violet熒光染料（這種染料可穿透細胞膜，與胞內蛋白質共價結合，用于追蹤細胞分裂。而且細胞每分裂一次，熒光強度減半）進行標記。將標記后的CAR-T細胞與5E4個Nalm6腫瘤細胞共培養(yǎng)。培養(yǎng)體系使用X-VIVO無血清培養(yǎng)基（不含IL-2,以排除外源細胞因子對增殖的干擾）。5天后通過流式檢測存活的CAR+細胞（通過死活染料排除死亡細胞，再通過CAR特異性抗體確認轉導成功），以及通過CellTrace Violet熒光強度的稀釋程度，熒光強度越低，說明細胞分裂次數(shù)越多。這樣結果用于量化CAR-T細胞在腫瘤抗原刺激下的增殖能力。
3.5 PBMC-humanized mouse model： 
雌性Nod.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ小鼠（這個小鼠重度免疫缺陷導致T/B細胞缺失；IL2rg基因敲除缺乏NK細胞；MHC I/II雙敲除）。Day -4，通過 尾靜脈注射 2.5E5個 Nalm6細胞。Day -1，用 IVIS測量小鼠腫瘤負荷。根據(jù)腫瘤大小隨機分組，確保組間基線一致。通過腹腔注射2E7個PBMCs。Day 0，腹腔注射攜帶CAR基因的 VivoVec病毒顆粒（劑量根據(jù)分組調整），體積200 μL。監(jiān)測指標腫瘤負荷和血液中的CAR T細胞生成及免疫細胞變化。這里作者用腹腔注射PBMC的原因是什么？腹腔內含大網(wǎng)膜、腸系膜淋巴結等次級淋巴器官，是免疫細胞歸巢和激活的理想場所。注入腹腔的PBMCs可通過 腹膜淋巴管進入循環(huán)系統(tǒng)（需2-5天）。實驗設計中，Day -1注射PBMCs后，Day 0給予VivoVec，預留了T細胞遷移至淋巴組織的時間。但是如果靜脈注射，PBMCs可能滯留肺部或脾臟，腹腔注射則提供更穩(wěn)定的局部微環(huán)境。
3.6 NHP model： 
該實驗將編碼抗CD20 CAR的VivoVec載體顆粒（VVPs）直接注射到豬尾獼猴的淋巴結內（最多4個，每處≤1mL）。每日監(jiān)測，記錄動物的體溫、活動狀態(tài)、食欲、糞便情況和整體健康狀況。實驗嚴格遵守動物倫理規(guī)范，每日監(jiān)測動物生理狀態(tài)，并在特定時間點采血進行流式分析（檢測CAR T細胞生成、免疫細胞表型等）、DNA檢測（用于后續(xù)的生物分布檢測，如ddPCR檢測載體基因組）及臨床生化檢驗（監(jiān)測血常規(guī)、生化指標等，評估潛在毒性或副作用，如CRS相關指標CRP、IL-6、鐵蛋白、肝酶ALT/AST等），以評估體內CAR T細胞的生成、功能、B細胞清除效果以及安全性。對出現(xiàn)CRS/ICANS跡象的動物，按方案使用了托珠單抗、阿那白滯素、地西泮進行治療，其中一只動物還使用了地塞米松。
3.7 MDF sequence：