Western實(shí)驗(yàn)中HIF-1α空白條帶的原因及解決方法

很多剛接觸HIF-1α的同學(xué)們很容易碰到一個(gè)問(wèn)題，就是做的Western老是空白條帶，什么都沒(méi)有。今天我們就帶著這個(gè)問(wèn)題，一起深入了解下這個(gè)缺氧大明星。

發(fā)現(xiàn)     

HIF-1的發(fā)現(xiàn)得感謝上面三位科學(xué)家。我們一直知道氧氣的重要性，卻不清楚細(xì)胞是如何適應(yīng)氧氣水平的變化。這三位科學(xué)家為大家揭示了細(xì)胞水平的分子機(jī)理以及核心蛋白HIF-1，從而獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

簡(jiǎn)單描述下發(fā)現(xiàn)的過(guò)程：首先在缺氧情況下，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin, EPO)會(huì)大量表達(dá)，然后發(fā)現(xiàn)了增強(qiáng)EPO表達(dá)的關(guān)鍵區(qū)域——缺氧反應(yīng)元件(Hypoxia Response Element，HRE)。最后發(fā)現(xiàn)與HRE特異性結(jié)合的蛋白——缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-Inducible Factor, HIF）。

結(jié)構(gòu)     
HIF-1結(jié)構(gòu)上是一個(gè)異源二聚體，其中一個(gè)命名為HIF-1α，另外一個(gè)，命名為HIF-1β。HIF-1β又叫芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)因子(Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator，ARNT)。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1β對(duì)氧氣含量的變化并不敏感，所以我們的主角就是HIF-1α了。
 
HIF家族結(jié)構(gòu)域示意圖
HIF家族有共同的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：一個(gè)是紫色部分的堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域(Basic Helix-Loop-Helix, bHLH)，一個(gè)是綠色部分的Per-ARNT-Sim結(jié)構(gòu)域(Periodicity-ARNT-Single-minded，PAS）。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域是 HIF-1α 和 HIF-1β 亞基形成異二聚體所必需的。

藍(lán)色是氧依賴(lài)降解結(jié)構(gòu)域(Oxygen-Dependent Degradation, ODD)，是HIF1受氧調(diào)控的關(guān)鍵部位，這個(gè)我們下部分細(xì)講。N-TAD和C-TAD是兩個(gè)反式激活結(jié)構(gòu)域(transactivation domain, TAD)，N-TAD位于ODD結(jié)構(gòu)域，C-TAD 可以和CBP/p300 等相互作用共同激活下游基因。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域共同負(fù)責(zé)HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性。

HIF-2α在 HIF-1α被發(fā)現(xiàn)不久后就被克隆出來(lái)了。HIF-2α與HIF-1α有 48% 的氨基酸序列是相同的，功能也類(lèi)似，可以與HIF-1β形成異二聚體并結(jié)合HRE。不過(guò)與HIF-1α的普遍表達(dá)不同的是，HIF-2α主要表達(dá)在肺，內(nèi)皮，頸動(dòng)脈中。

后來(lái)發(fā)現(xiàn)的HIF-3α也在多種組織中表達(dá)，同樣與 HIF-1β 形成異二聚體并結(jié)合HRE。不過(guò)目前HIF-1α 和 HIF-2α研究更加廣泛，而HIF-3α和其他HIF亞型研究較少，還有待大家去研究。

降解     
為什么HIF-1α Western難做呢，主要就是因?yàn)槌Ｑ蹩焖俳到�，還沒(méi)等你檢測(cè)，就已經(jīng)沒(méi)有了。
 
HIF-1α信號(hào)通路
我們一起來(lái)看上面的通路圖，在常氧條件下，HIF-1α 會(huì)發(fā)生脯氨酸羥基化（402和564位點(diǎn)都是脯氨酸），細(xì)心的同學(xué)還可以看到圖中K532也同時(shí)發(fā)生了乙�；�。這時(shí)馮·希佩爾-林道腫瘤抑制蛋白(von Hippel-Lindau tumor suppressor protein，VHL) 就會(huì)結(jié)合到HIF-1α，發(fā)生泛素化，形成E3泛素連接酶復(fù)合體。隨后發(fā)生蛋白酶體降解。

而在右邊的缺氧條件下，HIF-1α沒(méi)有了VHL這個(gè)蛋白的限制，不發(fā)生泛素化降解，從而不斷積累進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控下游基因的表達(dá)。如果我們使用一些羥化酶抑制劑，例如DFO去鐵胺和氯化鈷等，同樣可以阻斷HIF-1α的降解，使HIF-1α的水平上調(diào)。

還需要注意的是，HIF-1α的降解不是只通過(guò)VHL調(diào)控。研究報(bào)道還有許多其他蛋白可以影響 HIF-1α的泛素化和穩(wěn)定性。例如P53可以通過(guò)MDM2來(lái)降解HIF-1α；Jab1又可以增加HIF-1α的表達(dá)水平。此外，VHL 也與 HIF-1信號(hào)通路的其他蛋白有相互作用，因此VHL調(diào)節(jié)的不僅只是HIF-1α 穩(wěn)定性。生物體如此復(fù)雜，大部分蛋白調(diào)控都是交錯(cuò)進(jìn)行的。

常見(jiàn)問(wèn)題     
1.無(wú)條帶
做HIF-1α蛋白最常見(jiàn)的問(wèn)題就是無(wú)條帶。在我們的咨詢中，無(wú)條帶的比例占到了80%。
碰到無(wú)條帶的情況，首先要確認(rèn)你的樣本是否表達(dá)或高表達(dá)HIF-1α，是否使用低氧誘導(dǎo)，低氧誘導(dǎo)是否成功，這些都可以通過(guò)上下游蛋表達(dá)變化以及功能實(shí)驗(yàn)去綜合判斷的。
有的同學(xué)說(shuō)我做的不是低氧誘導(dǎo)，是藥物誘導(dǎo)，那么最好在旁邊添加一個(gè)低氧誘導(dǎo)的陽(yáng)性對(duì)照來(lái)排查問(wèn)題。

小優(yōu)細(xì)節(jié)君建議
陽(yáng)性對(duì)照推薦0.5%氧氣培養(yǎng)24h。如果沒(méi)有低氧培養(yǎng)箱，建議使用氯化鈷(100µM，4h)或者DMOG(1mM，6h)來(lái)處理細(xì)胞。
如果樣本表達(dá)和低氧誘導(dǎo)都沒(méi)有問(wèn)題，還有一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)需要注意，就是蛋白提取操作是否成功。因?yàn)镠IF-1α低氧誘導(dǎo)后主要在細(xì)胞核累積，所以提取蛋白時(shí)使用的裂解液和方法要充分裂解核蛋白。
建議使用裂解效果強(qiáng)的RIPA裂解液或者SDS裂解液，保證可以裂解核膜。裂解完增加超聲步驟，完全破碎細(xì)胞膜和細(xì)胞核膜，打斷DNA，充分釋放蛋白，同時(shí)可以增加樣本的均一性。建議每次超5～10S，間隔20S，共三個(gè)循環(huán)。超聲時(shí)需要根樣本體積及所用的探頭大小調(diào)整超聲功率，盡量保證在超聲過(guò)程中樣本不起泡，超聲后樣本變得澄清。
如果有同學(xué)說(shuō)實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有超聲儀器怎么辦，可以使用1ml注射器，來(lái)回抽進(jìn)打出5～10次，到?jīng)]有阻力為止。做Western時(shí)也可以做一下核內(nèi)參。

2.條帶位置不對(duì)
HIF-1α理論分子量在93KD，實(shí)際上由于蛋白的多種修飾，尤其是泛素化修飾，呈現(xiàn)出來(lái)的分子量在110-120KD左右。我們之前就碰到有同學(xué)只裁窄窄的兩個(gè)marker之間的部分，很有可能將目的蛋白丟失。
小優(yōu)細(xì)節(jié)君建議
在跑HIF-1α一定要把膜裁寬一些，將70-150KD蛋白全部轉(zhuǎn)上去。這里還需要注意，預(yù)染marker由于偶聯(lián)了染料，出現(xiàn)5-10KD遷移偏差是很正常的現(xiàn)象。如果樣本條帶趨勢(shì)符合造模，且條帶位置和陽(yáng)性對(duì)照一致，只是條帶出現(xiàn)在了130 KD位置，我們可以基本確認(rèn)是目的條帶。
3.為什么HIF-1β/ARNT能做出來(lái)，HIF-1α做不出來(lái)？
這個(gè)問(wèn)題其實(shí)仔細(xì)看過(guò)上文的同學(xué)們是可以找到答案的。因?yàn)镠IF-1β對(duì)氧氣含量的變化并不敏感，也就是說(shuō)正常的細(xì)胞組織是可以檢測(cè)出HIF-1β的。我們看下圖，同樣的HepG2細(xì)胞，只有CoCl2處理后才能檢測(cè)到HIF-1α，而未處理的HepG2就可以檢測(cè)到HIF-1β。
小優(yōu)細(xì)節(jié)君建議
如果想通過(guò)其他亞型的表達(dá)情況來(lái)確認(rèn)HIF-1α表達(dá)，建議可以做下HIF-2α。這兩個(gè)蛋白比較相近，可以說(shuō)明一定問(wèn)題。

部分推薦產(chǎn)品：

貨號(hào)	名稱(chēng)
36169	HIF-1α (D1S7W) XP® Rabbit mAb
14179	HIF-1α (D2U3T) Rabbit mAb
NB100-105	HIF-1 alpha Antibody
NB100-479	Rabbit Polyclonal HIF-1 alpha Antibody
abs130612	Rabbit anti-HIF1A Polyclonal Antibody
abs120168	Rabbit Anti-HIF-1 Alpha Polyclonal Antibody

參考文獻(xiàn)：
1. Qingdong Ke, Max Costa. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 2006 Nov;70(5):1469-80.
2. G L Semenza. HIF-1 and mechanisms of hypoxia sensing. Curr Opin Cell Biol. 2001 Apr;13(2):167-71.
3. Johannes Schödel, Peter J Ratcliffe. Mechanisms of hypoxia signalling: new implications for nephrology. Nat Rev Nephrol. 2019 Oct;15(10):641-659.