利用密度梯度離心分離循環(huán)腫瘤細胞的方法及步驟
今天為大家介紹使用密度梯度離心的方法（Ficoll,Percoll）分離循環(huán)腫瘤細胞（CTC）的策略。
循環(huán)腫瘤細胞CTCs簡介
1869年，Ashworth,T.R等【1】首次在一例轉(zhuǎn)移性腫瘤患者血液中觀察到循環(huán)腫瘤細胞（Circulating Tumor Cells, CTCs）。CTCs即是指從原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移灶脫落，進入血液循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細胞【2】，如圖1。
原發(fā)腫瘤釋放CTCs進入循環(huán)中，大部分CTCs死亡，但是少部分CTCs存活并在遠端形成轉(zhuǎn)移灶【9】。
每天每g原位瘤可能會釋放多達百萬的腫瘤細胞進入血液循環(huán)【3】，但大部分因血流剪切力、失巢凋亡、免疫系統(tǒng)識別【4】而被清除，只有極少數(shù)（0.01%）【4】【5】存活下來，通過血液或淋巴到達遠端器官形成新的轉(zhuǎn)移灶，是腫瘤轉(zhuǎn)移（Metastasis）和復發(fā)的重要生物學基礎之一。
因此，CTCs是腫瘤精準醫(yī)療的重要靶點【6】，作為液體活檢（其它如cfDNA、cfRNA、microRNA、外泌體、腫瘤代謝物）重要組成之一，其完整細胞的特有屬性，允許通過表型、基因型（如單細胞測序）、細胞功能以及異種移植模型，用于腫瘤早期診斷、疾病進展、復發(fā)檢測、轉(zhuǎn)移癌監(jiān)控、腫瘤亞型改變、耐藥性研究以及預后評估【7】，促進個體化治療實施。
此外，CTCs攜帶了腫瘤的基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組等多組學信息，可用于研究腫瘤微環(huán)境、轉(zhuǎn)移微環(huán)境PMN、免疫逃逸機制，還可用于培養(yǎng)類器官【8】進行體外藥物篩選和檢測。
CTCs的分離方法
CTCs的分離方法，主要分為非標記法和標記法，如圖2。
非標記法
主要依賴CTCs自身的物理性質(zhì)，如大小、密度、粘附、介電性質(zhì)和變形性【11】【12】。被廣泛使用的Cytiva Ficoll-Paque 和Percoll分離液即基于密度分離。大小和變形性等則常用于微流控技術【13】。
標記法
主要為陽性富集（如上皮細胞粘附分子EpCAM【14】、HER2、束絲蛋白3【15】、前列腺特異性抗原PSA【16】等或Cocktail）和陰性富集（如CD45抗體去除白細胞、CD61去除血小板和巨核細胞【17】、CD14等或Cocktail）。
基于抗EpCAM免疫磁珠技術的CellSearch CTC Test方法，是目前唯一被美國FDA批準作為腫瘤預后評估工具用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌（2004年）【18】、結直腸癌（2007年）【19】和前列腺癌（2008年）【20】。
中國CFDA在2012年批準了CellSearch系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的預后評估。其它本土獲批產(chǎn)品包括CytoSorter循環(huán)腫瘤細胞檢測系統(tǒng)等，更多檢測方法也在興起和驗證中。
CTCs的分離也可以聯(lián)合非標記和標記法【21】，并受到腫瘤類型的影響【17】。
但是，CTCs分離仍面臨挑戰(zhàn)：
腫瘤細胞本身即具有異質(zhì)性。并且，CTCs因上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）失去極性和黏附性，獲得更強的遷移和侵襲能力，與基質(zhì)互作并抵抗治療，同時表現(xiàn)出上皮和間質(zhì)表型【22】，也造成細胞表面Marker的動態(tài)變化。此外，CTCs還會和血液中其它細胞如白細胞形成CTC微血栓促進自身生存和轉(zhuǎn)移。
CTCs在血液中的密度很低，~1-10 CTCs/mL血液【10】，分離富集挑戰(zhàn)大。一般，轉(zhuǎn)移性癌癥中每10 mL血液中有0-100個單體CTCs以及0-5個CTCs Cluster（CTCs簇），并與癌癥類型、血液收集位置以及治療階段有關【23】。CTCs半衰期通常只有 1.0‑2.4 h【24】。
使用密度梯度離心法分離CTCs
早在1959年，Seal SH等【25】即使用硅油配制密度梯度離心介質(zhì)，分離血液中的游離腫瘤細胞。
目前，商品化的梯度介質(zhì)，如Cytiva的Ficoll-Paque進行CTCs的分離，在臨床研究中被廣泛使用【21】【26】【27】【28】。
作為非標記的分離方法，利于富集表面Marker表達異質(zhì)性CTCs以及未知CTCs亞型，操作簡單、低成本、快速，處理通量大。
使用密度梯度介質(zhì)分離CTCs，文獻報道中主要包括4種方法：常規(guī)標準操作、抗體預先結合雜質(zhì)細胞、抗體預先結合CTCs目的細胞，以及使用Percoll不連續(xù)密度梯度進行分離。
使用Ficoll-Paque進行CTCs分離的常規(guī)操作
根據(jù)斯托克斯定律，如圖3，顆粒的沉降速率v，和顆粒直徑（d）、樣品密度（ρp）和溶液密度（ρl）之差成正比；與溶液的粘稠度（η）成反比。當不同細胞經(jīng)過同一密度離心介質(zhì)，不同顆粒直徑和密度的細胞，沉降速率不同，從而被分開。
外周血中，紅細胞、粒細胞密度大【38】如圖6，穿過Ficoll-Paque密度梯度介質(zhì)（1.077 g/mL）沉于底層；外周血單個核細胞PBMCs和CTCs密度小，一起停留在白膜層（buffy coat）中，最上面是血漿。
后續(xù)可以使用陽性富集【29】或陰性富集（如anti-CD45磁珠去除白細胞）【30】【39】進一步回收CTCs。
抗體結合雜質(zhì)細胞后，再使用密度梯度介質(zhì)分離CTCs
在密度梯度分離之前，進行雜質(zhì)細胞預標記，促進其沉降。例如采用anti-CD45（白細胞共同抗原）【8】【32】【33】、anti-66b（粒細胞）與樣品進行孵育，使白細胞與紅細胞形成免疫玫瑰花狀結構，密度和大小增加，在后續(xù)密度梯度離心過程中，將白細胞群拉到管底，則在白膜層可以回收更純的CTCs，如圖4，少量CTCs可能會滲漏到血漿層，也可以一起回收【6】【32】。
相對于陽性篩選，基于去除白細胞的陰性篩選更有優(yōu)勢，避免了使用抗體激活CTCs以及某些CTCs因為不表達相應的抗原而被遺漏【32】。
將血液和白細胞抗體如RosetteSep抗體孵育，使用DPBS+2% FBS稀釋血樣，然后小心地鋪到Ficoll-Paque 密度梯度介質(zhì)上面，離心（關閉剎車）后在白膜層收獲CTCs【32】。
抗體結合目的CTCs后，再使用密度梯度介質(zhì)分離CTCs
在密度梯度分離之前，進行CTCs目的細胞預標記，促進其沉降。
Huang Q等【34】使用同時偶聯(lián)anti‑EpCAM抗體和anti‑CD146抗體（后者作為腫瘤標志物以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化EMT誘導劑，利于捕獲EpCAM無/低表達間質(zhì)CTCs）的SiO2微珠（表面包被可降解明膠），先和血樣孵育以結合CTCs，之后將樣品鋪在Cytiva Percoll密度梯度介質(zhì)（配制成1.15 g/mL）的表面，離心，CTCs結合在微珠表面而沉降于管底，之后酶解表層明膠釋放CTCs，結果顯示CTCs收率＞80%，純度大于85%，如圖5。
也可以使用Ficoll-Paque密度梯度介質(zhì)，采用類似方法離心沉降CTCs目的細胞，收集管底組分并裂紅，回收CTCs。
圖5：基于微珠和密度梯度介質(zhì)進行CTCs分離（部分圖片）
A：通過可降解明膠包被的微珠（偶聯(lián)了anti-EpCAM和anti-CD146抗體），高效吸附CTCs。
B：經(jīng)過Percoll密度梯度離心，將結合CTCs的二氧化硅微珠沉淀到管底，從而和血細胞分離。
C：通過基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9酶解明膠，釋放結合在微珠表面的CTCs。
除了CTCs單細胞外，CTC Cluster【35】以及CTCs與其它血液成分組成的細胞團，往往具有更高的轉(zhuǎn)移潛能。由于細胞團的密度更大，容易在離心后沉降，也可以采用類似方法進行分離，或使用Cluster-Chip【36】。
另外，具有干性的CTCs，即循環(huán)癌干細胞（Circulating Cancer Stem Cells，CCSCs）同樣值得關注。
Ficoll Premium系列三款產(chǎn)品
Ficoll產(chǎn)品可以分為Ficoll-Paque Plus和Ficoll-Paque Premium兩大系列，Premium系列是在嚴格控制的環(huán)境下生產(chǎn)的（符合ISO 13485:2003，依從美國藥典章節(jié)<1043>的相關規(guī)定，具有法規(guī)支持文件 (RSF)），因此推薦可用作臨床研究和細胞治療，其成分與Ficoll-Paque plus沒有區(qū)別。
此外，F(xiàn)icoll-Paque premium產(chǎn)品具有1.077，1.084和1.073三種密度，為客戶提供更多的密度選擇。具體密度適用范圍參照下表：
產(chǎn)品選擇指南：
循環(huán)腫瘤細胞CTCs簡介
1869年，Ashworth,T.R等【1】首次在一例轉(zhuǎn)移性腫瘤患者血液中觀察到循環(huán)腫瘤細胞（Circulating Tumor Cells, CTCs）。CTCs即是指從原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移灶脫落，進入血液循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細胞【2】，如圖1。
圖1：循環(huán)腫瘤細胞CTCs進入血液循環(huán)
原發(fā)腫瘤釋放CTCs進入循環(huán)中，大部分CTCs死亡，但是少部分CTCs存活并在遠端形成轉(zhuǎn)移灶【9】。
每天每g原位瘤可能會釋放多達百萬的腫瘤細胞進入血液循環(huán)【3】，但大部分因血流剪切力、失巢凋亡、免疫系統(tǒng)識別【4】而被清除，只有極少數(shù)（0.01%）【4】【5】存活下來，通過血液或淋巴到達遠端器官形成新的轉(zhuǎn)移灶，是腫瘤轉(zhuǎn)移（Metastasis）和復發(fā)的重要生物學基礎之一。
因此，CTCs是腫瘤精準醫(yī)療的重要靶點【6】，作為液體活檢（其它如cfDNA、cfRNA、microRNA、外泌體、腫瘤代謝物）重要組成之一，其完整細胞的特有屬性，允許通過表型、基因型（如單細胞測序）、細胞功能以及異種移植模型，用于腫瘤早期診斷、疾病進展、復發(fā)檢測、轉(zhuǎn)移癌監(jiān)控、腫瘤亞型改變、耐藥性研究以及預后評估【7】，促進個體化治療實施。
此外，CTCs攜帶了腫瘤的基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組等多組學信息，可用于研究腫瘤微環(huán)境、轉(zhuǎn)移微環(huán)境PMN、免疫逃逸機制，還可用于培養(yǎng)類器官【8】進行體外藥物篩選和檢測。
CTCs的分離方法
CTCs的分離方法，主要分為非標記法和標記法，如圖2。
圖2：CTCs分離、培養(yǎng)和分析方法【10】
非標記法
主要依賴CTCs自身的物理性質(zhì)，如大小、密度、粘附、介電性質(zhì)和變形性【11】【12】。被廣泛使用的Cytiva Ficoll-Paque 和Percoll分離液即基于密度分離。大小和變形性等則常用于微流控技術【13】。
標記法
主要為陽性富集（如上皮細胞粘附分子EpCAM【14】、HER2、束絲蛋白3【15】、前列腺特異性抗原PSA【16】等或Cocktail）和陰性富集（如CD45抗體去除白細胞、CD61去除血小板和巨核細胞【17】、CD14等或Cocktail）。
基于抗EpCAM免疫磁珠技術的CellSearch CTC Test方法，是目前唯一被美國FDA批準作為腫瘤預后評估工具用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌（2004年）【18】、結直腸癌（2007年）【19】和前列腺癌（2008年）【20】。
中國CFDA在2012年批準了CellSearch系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的預后評估。其它本土獲批產(chǎn)品包括CytoSorter循環(huán)腫瘤細胞檢測系統(tǒng)等，更多檢測方法也在興起和驗證中。
CTCs的分離也可以聯(lián)合非標記和標記法【21】，并受到腫瘤類型的影響【17】。
但是，CTCs分離仍面臨挑戰(zhàn)：
腫瘤細胞本身即具有異質(zhì)性。并且，CTCs因上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）失去極性和黏附性，獲得更強的遷移和侵襲能力，與基質(zhì)互作并抵抗治療，同時表現(xiàn)出上皮和間質(zhì)表型【22】，也造成細胞表面Marker的動態(tài)變化。此外，CTCs還會和血液中其它細胞如白細胞形成CTC微血栓促進自身生存和轉(zhuǎn)移。
CTCs在血液中的密度很低，~1-10 CTCs/mL血液【10】，分離富集挑戰(zhàn)大。一般，轉(zhuǎn)移性癌癥中每10 mL血液中有0-100個單體CTCs以及0-5個CTCs Cluster（CTCs簇），并與癌癥類型、血液收集位置以及治療階段有關【23】。CTCs半衰期通常只有 1.0‑2.4 h【24】。
使用密度梯度離心法分離CTCs
早在1959年，Seal SH等【25】即使用硅油配制密度梯度離心介質(zhì)，分離血液中的游離腫瘤細胞。
目前，商品化的梯度介質(zhì)，如Cytiva的Ficoll-Paque進行CTCs的分離，在臨床研究中被廣泛使用【21】【26】【27】【28】。
作為非標記的分離方法，利于富集表面Marker表達異質(zhì)性CTCs以及未知CTCs亞型，操作簡單、低成本、快速，處理通量大。
使用密度梯度介質(zhì)分離CTCs，文獻報道中主要包括4種方法：常規(guī)標準操作、抗體預先結合雜質(zhì)細胞、抗體預先結合CTCs目的細胞，以及使用Percoll不連續(xù)密度梯度進行分離。
使用Ficoll-Paque進行CTCs分離的常規(guī)操作
根據(jù)斯托克斯定律，如圖3，顆粒的沉降速率v，和顆粒直徑（d）、樣品密度（ρp）和溶液密度（ρl）之差成正比；與溶液的粘稠度（η）成反比。當不同細胞經(jīng)過同一密度離心介質(zhì)，不同顆粒直徑和密度的細胞，沉降速率不同，從而被分開。
外周血中，紅細胞、粒細胞密度大【38】如圖6，穿過Ficoll-Paque密度梯度介質(zhì)（1.077 g/mL）沉于底層；外周血單個核細胞PBMCs和CTCs密度小，一起停留在白膜層（buffy coat）中，最上面是血漿。
后續(xù)可以使用陽性富集【29】或陰性富集（如anti-CD45磁珠去除白細胞）【30】【39】進一步回收CTCs。
圖3：顆粒沉降速率公式【31】
抗體結合雜質(zhì)細胞后，再使用密度梯度介質(zhì)分離CTCs
在密度梯度分離之前，進行雜質(zhì)細胞預標記，促進其沉降。例如采用anti-CD45（白細胞共同抗原）【8】【32】【33】、anti-66b（粒細胞）與樣品進行孵育，使白細胞與紅細胞形成免疫玫瑰花狀結構，密度和大小增加，在后續(xù)密度梯度離心過程中，將白細胞群拉到管底，則在白膜層可以回收更純的CTCs，如圖4，少量CTCs可能會滲漏到血漿層，也可以一起回收【6】【32】。
相對于陽性篩選，基于去除白細胞的陰性篩選更有優(yōu)勢，避免了使用抗體激活CTCs以及某些CTCs因為不表達相應的抗原而被遺漏【32】。
圖4：使用Ficoll-Paque 密度梯度介質(zhì)，分離CTCs
將血液和白細胞抗體如RosetteSep抗體孵育，使用DPBS+2% FBS稀釋血樣，然后小心地鋪到Ficoll-Paque 密度梯度介質(zhì)上面，離心（關閉剎車）后在白膜層收獲CTCs【32】。
抗體結合目的CTCs后，再使用密度梯度介質(zhì)分離CTCs
在密度梯度分離之前，進行CTCs目的細胞預標記，促進其沉降。
Huang Q等【34】使用同時偶聯(lián)anti‑EpCAM抗體和anti‑CD146抗體（后者作為腫瘤標志物以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化EMT誘導劑，利于捕獲EpCAM無/低表達間質(zhì)CTCs）的SiO2微珠（表面包被可降解明膠），先和血樣孵育以結合CTCs，之后將樣品鋪在Cytiva Percoll密度梯度介質(zhì)（配制成1.15 g/mL）的表面，離心，CTCs結合在微珠表面而沉降于管底，之后酶解表層明膠釋放CTCs，結果顯示CTCs收率＞80%，純度大于85%，如圖5。
也可以使用Ficoll-Paque密度梯度介質(zhì)，采用類似方法離心沉降CTCs目的細胞，收集管底組分并裂紅，回收CTCs。
圖5：基于微珠和密度梯度介質(zhì)進行CTCs分離（部分圖片）
A：通過可降解明膠包被的微珠（偶聯(lián)了anti-EpCAM和anti-CD146抗體），高效吸附CTCs。
B：經(jīng)過Percoll密度梯度離心，將結合CTCs的二氧化硅微珠沉淀到管底，從而和血細胞分離。
C：通過基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9酶解明膠，釋放結合在微珠表面的CTCs。
除了CTCs單細胞外，CTC Cluster【35】以及CTCs與其它血液成分組成的細胞團，往往具有更高的轉(zhuǎn)移潛能。由于細胞團的密度更大，容易在離心后沉降，也可以采用類似方法進行分離，或使用Cluster-Chip【36】。
另外，具有干性的CTCs，即循環(huán)癌干細胞（Circulating Cancer Stem Cells，CCSCs）同樣值得關注。
細胞分離液產(chǎn)品是經(jīng)典的無菌即開即用型密度梯度介質(zhì)，可以根據(jù)細胞密度的不同從樣品中分離出目標細胞，具有高活性，高純度，高回收率等特點。
Ficoll Premium系列三款產(chǎn)品
Ficoll產(chǎn)品可以分為Ficoll-Paque Plus和Ficoll-Paque Premium兩大系列，Premium系列是在嚴格控制的環(huán)境下生產(chǎn)的（符合ISO 13485:2003，依從美國藥典章節(jié)<1043>的相關規(guī)定，具有法規(guī)支持文件 (RSF)），因此推薦可用作臨床研究和細胞治療，其成分與Ficoll-Paque plus沒有區(qū)別。
此外，F(xiàn)icoll-Paque premium產(chǎn)品具有1.077，1.084和1.073三種密度，為客戶提供更多的密度選擇。具體密度適用范圍參照下表：
產(chǎn)品選擇指南：
|
貨號 |
品名 |
規(guī)格 |
適用細胞類型 |
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FICOLL PAQUE PLUS 1.077 |
6X100ML |
人外周血，臍帶血，骨髓等樣品中分離單個核細胞 |
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FICOLL PAQUE PLUS 1.077 |
6X500ML |
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FICOLL PAQUE PREMIUM 1.077 |
6X100ML |
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FICOLL PAQUE PREMIUM 1.077 |
6X500ML |
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Ficoll-Paque PREMIUM 1.084 |
6X100ML |
大/小鼠血液,骨髓，組織中分離單個核細胞。 |
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Ficoll-Paque PREMIUM 1.073 |
6X100ML |
分離人低密度細胞，如基質(zhì)細胞，間充質(zhì)干細胞。 |
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PERCOLL |
250ML |
通用細胞分離，可稀釋成不同密度，可用來分離各種細胞及細胞器。如：中性粒細胞，單核細胞，腫瘤浸潤淋巴細胞，巨噬細胞，病毒等等。 |
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PERCOLL |
6X1L |
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PERCOLL |
1L |
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Percol1 PLUS 250 ML |
250ML |
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PERCOLL PLUS |
1L |
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