斑馬魚活體熒光實(shí)時(shí)成像分鐘級(jí)動(dòng)態(tài)捕捉血栓形成與血管發(fā)育

本研究成果由Yuta Imai, Satoru Ozaki, Taiki Noda, Isao Kobayashi, Kayo Sugitani, Satomi Kasashima, Eriko Morishita & Yuhei Araiso共同完成，論文題為《Real-time imaging of blood coagulation and angiogenesis during development in a zebrafish model of type I antithrombin deficiency》，于2025年5月發(fā)表在《Scientific Reports》。

重要發(fā)現(xiàn)
01基因編輯模型的建立與驗(yàn)證
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向斑馬魚SERPINC1基因外顯子1，成功構(gòu)建了雜合子（zAT+/-）和純合子（zAT-/-）突變體�；�因測(cè)序顯示突變導(dǎo)致5個(gè)堿基缺失（ACTTA）及單堿基插入（C），造成蛋白質(zhì)框架移位和提前終止。Western blot檢測(cè)證實(shí)，zAT-/-幼魚血漿中AT蛋白表達(dá)量?jī)H為野生型（zAT+/+）的2%，符合I型AT缺乏癥的核心特征——蛋白分泌障礙。

血栓多樣性：在8日齡幼魚中，zAT+/-和zAT-/-組存活率均顯著降低至88%�；铙w成像顯示，突變體出現(xiàn)心臟內(nèi)血栓、鰭血管（PFV）閉塞及后主靜脈（PCV）血流中斷，嚴(yán)重者甚至因全身血管栓塞死亡。

纖維蛋白沉積：免疫熒光染色證實(shí)，全身栓塞幼魚的心臟周圍血管存在顯著纖維蛋白沉積，證明凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的異常激活。

30小時(shí)關(guān)鍵期：zAT-/-胚胎的節(jié)間血管（ISV）形成率顯著降低（65.8% vs 野生型82.0%），長(zhǎng)度縮短約7%。

5日齡恢復(fù)：血管結(jié)構(gòu)最終恢復(fù)正常，表明AT缺乏不影響血管最終形態(tài)，這與傳統(tǒng)認(rèn)知中AT的抗血管生成作用相悖。

基因表達(dá)分析進(jìn)一步揭示生存關(guān)鍵：zAT-/-幼魚通過(guò)上調(diào)纖溶酶原（PLG）基因促進(jìn)血栓溶解，并下調(diào)凝血酶原（F2）基因減少凝血酶生成，形成獨(dú)特的抗血栓代償機(jī)制。

創(chuàng)新與亮點(diǎn)
01技術(shù)突破：活體血栓動(dòng)態(tài)成像平臺(tái)
本研究首次將CRISPR/Cas9基因編輯與雙熒光標(biāo)記活體成像技術(shù)結(jié)合，攻克了哺乳動(dòng)物模型中胚胎致死的觀測(cè)難題。通過(guò)熒光體視顯微鏡，實(shí)現(xiàn)了血栓形成、血管發(fā)育的分鐘級(jí)動(dòng)態(tài)捕捉，為凝血疾病研究提供了高時(shí)空分辨率的可視化工具。

總結(jié)與展望
本研究通過(guò)創(chuàng)新性基因編輯與活體成像技術(shù)，首次在斑馬魚模型中實(shí)現(xiàn)了I型AT缺乏癥的血栓形成與血管發(fā)育實(shí)時(shí)觀測(cè)，突破性地發(fā)現(xiàn)幼魚通過(guò)PLG上調(diào)和F2下調(diào)的代償機(jī)制存活。這一成果不僅為遺傳性凝血疾病的機(jī)制研究提供了全新視角，其建立的實(shí)時(shí)成像平臺(tái)更為抗血栓藥物開(kāi)發(fā)提供了高效工具。

未來(lái)研究方向包括：

1）深入解析PLG/F2基因調(diào)控的分子信號(hào)通路；

2）利用該模型篩選靶向代償通路的小分子藥物；

3）探索AT缺乏癥中血管代償與腫瘤血管生成的關(guān)聯(lián)性。

隨著技術(shù)的迭代，活體成像驅(qū)動(dòng)的斑馬魚模型有望成為凝血疾病從機(jī)制研究到臨床轉(zhuǎn)化的核心平臺(tái)，為精準(zhǔn)醫(yī)療提供新引擎。

DOI:10.1038/s41598-025-01658-z.