巨噬細(xì)胞的來源、誘導(dǎo)分化與培養(yǎng)、鑒定及熱門研究

巨噬細(xì)胞（Macrophages，mø）作為先天免疫的核心成員，可以通過吞噬作用清除病原體、死亡細(xì)胞和異物；同時具備抗原呈遞功能，將處理后的病原體片段呈遞給T細(xì)胞，啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答。不僅如此，巨噬細(xì)胞還能夠在特定組織中分化成功能不一的組織駐留巨噬細(xì)胞：如庫普弗細(xì)胞（肝臟）、小膠質(zhì)細(xì)胞（腦部）等。

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接下來小優(yōu)會從巨噬細(xì)胞來源-誘導(dǎo)分化與培養(yǎng)-鑒定-熱門研究四個方面帶大家通關(guān)不同來源的NK細(xì)胞培養(yǎng)！

巨噬細(xì)胞來源
在骨髓中，造血干細(xì)胞分化為單核細(xì)胞前體細(xì)胞（MDCP），再進(jìn)一步分化為兩種單核細(xì)胞亞群，即Ly6C+CX3CR1loCCR2+CD62L+和Ly6CloCX3CR1hiCCR2−CD62L−。這兩種單核細(xì)胞均可以通過CCR2和MCP-3信號傳導(dǎo)被動員至血液，一旦進(jìn)入血管，單核細(xì)胞就可以通過血管外滲離開血管，并通過CCR2和CX3CR1信號傳導(dǎo)到達(dá)組織成為各具特點的組織駐留巨噬細(xì)胞[1]。所以體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞來源可以是實體組織（骨髓、脾臟、肝臟、淋巴結(jié)等）、血液、直接購買商品化的原代單核/巨噬細(xì)胞（4W-400）或單核/巨噬細(xì)胞系（THP1、Raw264.7等）。

巨噬細(xì)胞發(fā)育[1]

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巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分化與培養(yǎng)
巨噬細(xì)胞分化是科學(xué)研究中很重要的一部分，由于巨噬細(xì)胞的可塑性，未分化的巨噬細(xì)胞（M0）分化為兩種類型：經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞（M1）和交替活化巨噬細(xì)胞（M2）。M1應(yīng)對LPS、IFN-γ等刺激，分泌大量的促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β等），發(fā)揮促炎、抗菌功能；而M2應(yīng)對 IL-4、IL-13等刺激，分泌大量的抗炎細(xì)胞因子（IL-10、IL-1RA等），發(fā)揮抗炎、促進(jìn)傷口愈合的作用[2]。

巨噬細(xì)胞分化[2]

體外實驗中也可以通過添加上述刺激物誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞的分化，接下來，小優(yōu)會從原代單核/巨噬細(xì)胞（單核來源的巨噬細(xì)胞、骨髓來源的巨噬細(xì)胞）、單核/巨噬細(xì)胞系（THP-1、U-937、Raw264.7、J774a.1）誘導(dǎo)分化與培養(yǎng)兩個方面為大家詳細(xì)介紹：
一、原代單核/巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分化
1.單核來源的巨噬細(xì)胞（Monocyte Derived Macrophage，MDM）分化成M1、M2[3]
單核來源的巨噬細(xì)胞由外周血單核細(xì)胞經(jīng)GM-CSF或M-CSF誘導(dǎo)分化而來，具有較強(qiáng)異質(zhì)性，可模擬炎癥狀態(tài)下單核細(xì)胞向組織遷移分化的過程，常用于研究感染、腫瘤等病理環(huán)境中的巨噬細(xì)胞功能。
①使用FICOLL PAQUE PLUS 1.077（17144003-1）從人的外周血中提取PBMC；
②使用CD14 MicroBeads, human（130-050-201）磁珠分選CD14+單核細(xì)胞；
③使用完全培養(yǎng)基（RPMI1640（SH30809.01）+10%FBS（SV30208.02）+1%PS（SV30010））重懸單核細(xì)胞，并以5*10^5/ml接種于12孔板，加入20 nM M-CSF（UA040128）; 
④培養(yǎng)7天，每3天更換一次培養(yǎng)基并添加M-CSF，即可獲得MDM（M0）；
⑤M1分化：向上述M0細(xì)胞中加入1 μg/ml LPS（abs47014848-5mg）和10 ng/ml IFN-γ（UA040065）培養(yǎng)48h；
⑥M2分化：向上述M0細(xì)胞中加入20 ng/ml IL-4（UA040192）和5 ng/ml IL-13（UA040158）培養(yǎng)48h。

2.骨髓來源的巨噬細(xì)胞（Bone Marrow Derived Macrophage，BMDM）分化成M1、M2[4]
骨髓來源的巨噬細(xì)胞由骨髓前體細(xì)胞經(jīng)M-CSF培養(yǎng)獲得，分化均一性高，增殖能力強(qiáng)，適合體外大規(guī)模實驗，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)免疫研究及藥物篩選。
① 處死小鼠后分離股骨和股骨，使用含2%FBS（SV30208.02）的PBS（SH30256.01）沖洗小鼠骨髓腔，收集沖洗液后反復(fù)吹打骨髓懸液，70 μm篩網(wǎng)（abs7232）過濾去除碎骨和團(tuán)塊；
②使用完全培養(yǎng)基（IMDM（SH30228.01）+10%FBS（SV30208.02））重懸骨髓細(xì)胞，并以2*10^6/ml接種于12孔板，加入10 ng/ml M-CSF（216-MCC-025/CF）；
③培養(yǎng)7天，每3天更換一次培養(yǎng)基并添加M-CSF，即可獲得BMDM（M0）；
注意：在第7天，可通過流式細(xì)胞術(shù)評估成熟BMDM（CD11b+F4/80+）的形成。
④M1分化：向上述M0細(xì)胞中加入100 ng/ml LPS（abs47014848-5mg）和50 ng/ml IFN-γ（285-IF-100/CF）培養(yǎng)48h；
⑤M2分化：向上述M0細(xì)胞中加入10 ng/ml IL-4（404-ML-010/CF）和10 ng/ml IL-13（285-IF-100/CF）培養(yǎng)48h。

小鼠BMDMs的分離、形成和刺激方案[4]

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二、單核/巨噬細(xì)胞系誘導(dǎo)分化
1.THP-1分化成M0、M1、M2[3, 5]
THP-1：人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系，可經(jīng)PMA（佛波酯）誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞，常用于研究炎癥、免疫調(diào)控及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的功能，適合模擬人源單核/巨噬細(xì)胞響應(yīng)。
①使用完全培養(yǎng)基（RPMI1640（SH30809.01）+10%FBS（SV30208.02）+1%PS（SV30010）+0.05mM β-巰基乙醇（abs9592-100mL））重懸THP-1細(xì)胞，并以5*10^5/ml接種于12孔板，加入100 ng/ml 佛波酯PMA（abs9107-5mg）,培養(yǎng)48h，即可獲得M0細(xì)胞；
②M1分化：向上述M0細(xì)胞中加入100 ng/ml LPS（abs47014848-10mg）和20 ng/ml IFN-γ（abs04123-50ug）培養(yǎng)48h；
③M2分化：向上述M0細(xì)胞中加入20 ng/ml IL-4（abs04698-100ug）和20 ng/ml IL-13（abs00816-10ug）培養(yǎng)48h。

2.U-937分化成M1、M2[6]
U-937：人淋巴瘤來源的單核細(xì)胞系，也可通過PMA分化為巨噬細(xì)胞，但分化效率低于THP-1，多用于病毒侵染、免疫代謝及腫瘤微環(huán)境研究。
①使用完全培養(yǎng)基（RPMI1640（SH30809.01）+10%FBS（SV30208.02）+1%PS（SV30010））重懸U-937細(xì)胞，并以2*10^6/ml接種于12孔板，加入100 ng/ml 佛波酯PMA（abs9107-5mg）,培養(yǎng)48h，移除PMA后，可靜置培養(yǎng)48–96小時，以形成穩(wěn)定M0表型；
②M1分化：向上述M0細(xì)胞中加入10 ng/ml LPS（abs47014848-10mg）和10 ng/ml IFN-γ（UA040065）培養(yǎng)48h；
③M2分化：向上述M0細(xì)胞中加入25 ng/ml IL-4（UA040192）和25 ng/ml IL-13（UA040158）培養(yǎng)48h。

3.Raw264.7分化成M1、M2[7]
RAW 264.7（相當(dāng)于M0）：Raw264.7：小鼠白血病來源的巨噬細(xì)胞系，無需誘導(dǎo)即可直接培養(yǎng)，增殖快且易轉(zhuǎn)染，廣泛用于炎癥信號通路（如NF-κB）、吞噬功能及脂代謝研究。
①使用完全培養(yǎng)基（DMEM（SH30243.01）+10%FBS（SV30208.02）+1%雙抗（SV30010））重懸RAW264.7細(xì)胞，并以2.5*10^5/ml接種于12孔板；
②M1分化：向上述RAW264.7細(xì)胞中加入100 ng/ml LPS（abs47014848-5mg）培養(yǎng)24h；
③M2分化：向上述RAW264.7細(xì)胞中加入20 ng/ml IL-4（404-ML-010/CF）培養(yǎng)24-48h。

4.J774A.1分化成M1、M2[8]
J774A.1（相當(dāng)于M0）：小鼠巨噬細(xì)胞系，具有較強(qiáng)吞噬活性，常用于細(xì)菌感染、泡沫細(xì)胞形成及細(xì)胞因子分泌研究，但分化特性較原代巨噬細(xì)胞弱。
①使用完全培養(yǎng)基（RPMI1640（SH30809.01）+10%FBS（SV30208.02）+1%PS（SV30010））重懸J774A.1細(xì)胞，并以1*10^5/ml接種于12孔板； 
②M1分化：向上述J774A.1細(xì)胞中加入100 ng/ml LPS（abs47014848-10mg）培養(yǎng)24h；
③M2分化：向上述J774A.1細(xì)胞中加入5ng/ml IL-13（abs00816-10ug）培養(yǎng)24h；
溫馨提示：關(guān)于單核巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)要點，大家可以看《Raw264.7、THP1、MH-S、J774A.1，單核-巨噬細(xì)胞系培養(yǎng)合集來襲！》這篇文章。

小優(yōu)也匯總了上述來源的巨噬細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化方案，可供參考~

巨噬細(xì)胞鑒定
巨噬細(xì)胞亞型（M1、M2）鑒定最常用的方法是流式。常用的巨噬細(xì)胞標(biāo)記物包括CD11b、CD14、CD16、CD68、F4/80（小鼠）。CD80和CD86常用作M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物，而CD163和CD206則為M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志。
另外需要注意的是，巨噬細(xì)胞具有異質(zhì)性，比如在小鼠的不同組織中，巨噬細(xì)胞對應(yīng)檢測指標(biāo)不同，大家可以參考下表。

小鼠組織駐留巨噬細(xì)胞對應(yīng)標(biāo)記物及功能[9]

除了流式細(xì)胞術(shù)，還可以使用qRT-PCR確定激活的M1和M2巨噬細(xì)胞特征基因的表達(dá)，包括IL-1β、TNF-α和IL-6（M1激活）或IL-10、IL-13、arginase1和PPARγ（M2激活）；或者通過Western blot分析確定參與M1或M2巨噬細(xì)胞激活的細(xì)胞信號通路的激活。

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巨噬細(xì)胞熱門研究
巨噬細(xì)胞的熱門研究也非常多，比如巨噬細(xì)胞的功能和調(diào)控機(jī)制、巨噬細(xì)胞與免疫逃逸、巨噬細(xì)胞與代謝（糖酵解、代謝重編程）等。例如《25-Hydroxycholesterol regulates lysosome AMP kinase activation and metabolic reprogramming to educate immunosuppressive macrophages》發(fā)現(xiàn)了一個新的巨噬細(xì)胞免疫代謝檢查點：CH25H（膽固醇-25-羥化酶）。TAMs中CH25H的表達(dá)增加，導(dǎo)致25HC（CH25H）在溶酶體中積累。25HC通過與GPR155-mTORC1復(fù)合體相互作用，抑制mTORC1，激活A(yù)MPKa，進(jìn)而磷酸化STAT6，增強(qiáng)其活性，促進(jìn)ARG1產(chǎn)生，增強(qiáng)TAMs的免疫抑制功能。另外，CH25H缺失的巨噬細(xì)胞可將“冷腫瘤”轉(zhuǎn)變?yōu)?ldquo;熱腫瘤”，提高抗PD-1療法的抗腫瘤效果。研究還表明，25HC促進(jìn)氧化磷酸化和線粒體功能，進(jìn)而使巨噬細(xì)胞向免疫抑制亞群分化。因此：靶向CH25H可改善抗腫瘤免疫反應(yīng)，為腫瘤治療提供新策略。
 

文章圖形摘要


巨噬細(xì)胞與代謝研究思路圖

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