T細(xì)胞激活的機(jī)制及其誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)操作方法
T 細(xì)胞在機(jī)體防御體系中扮演著不可或缺的角色，它不僅是清除病原體的"主力軍"，還是維持免疫記憶的"守護(hù)者"，保護(hù)機(jī)體免受再次侵害！在體外實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo) T 細(xì)胞對(duì)免疫反應(yīng)，尤其是 CAR-T 療法的深入研究意義重大......
Section.01
T 細(xì)胞激活的機(jī)制
T 細(xì)胞的活化需要兩種信號(hào)的共同參與。
第一信號(hào)是 TCR-CD3 的復(fù)合物，其傳導(dǎo)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間決定了 T 細(xì)胞的激活程度，其中 TCR 特異性地識(shí)別抗原肽-MHC 復(fù)合物，CD3 將識(shí)別的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)部。研究表明，通過調(diào)節(jié) CD3 的信號(hào)傳導(dǎo)，可以增強(qiáng)或抑制 T 細(xì)胞的免疫反應(yīng)。例如，CD3 抗體 (如 OKT3) 能夠識(shí)別 TCR-CD3 復(fù)合體上 CD3 分子的 ε 鏈，模擬抗原-MHC 的作用，直接激活 T 細(xì)胞，調(diào)節(jié) T 細(xì)胞的增殖[1][2]。
T 細(xì)胞激活還需要第二信號(hào)，即共刺激信號(hào)。最常見的共刺激分子是 CD28，它可以和樹突狀細(xì)胞表面的 B7 分子結(jié)合，共同促進(jìn) T 細(xì)胞的激活過程，并且增強(qiáng) T 細(xì)胞的增殖和分化。CD28 抗體可以通過不同的機(jī)制激活或抑制 T 細(xì)胞活性，為免疫調(diào)節(jié)提供了重要工具[3]。
在這場 "免疫交響曲" 中，樹突狀細(xì)胞不僅是抗原呈遞的 "指揮官"，還是細(xì)胞因子的 "生產(chǎn)者"。樹突狀細(xì)胞可以分泌細(xì)胞因子，如 IL-2、IL-12，進(jìn)一步誘導(dǎo) T 細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo) CD4+ T 細(xì)胞分化，增加 CD8+ T 細(xì)胞的細(xì)胞毒性，支持免疫記憶細(xì)胞的形成。
圖 1. T 細(xì)胞激活的主要信號(hào)[4]。
信號(hào) 1：TCR 與 CD3 結(jié)合，傳遞 pMHC 信號(hào)；信號(hào) 2：共刺激信號(hào) CD28 與 B7 分子（CD80/86）結(jié)合，促進(jìn) T 細(xì)胞的增殖和激活；信號(hào) 3：細(xì)胞因子，如 IL-2 和 IL-12，調(diào)節(jié) T 細(xì)胞的增殖和分化。
當(dāng) T 細(xì)胞被激活后，它們會(huì)退出靜止?fàn)顟B(tài)，進(jìn)入快速的克隆擴(kuò)增階段。被激活的 T 細(xì)胞會(huì)多次分裂，產(chǎn)生大量具有相同 TCR 的子代細(xì)胞。這些子代細(xì)胞將進(jìn)一步分化為效應(yīng) T 細(xì)胞和記憶 T 細(xì)胞。效應(yīng) T 細(xì)胞如 CD4+ T 細(xì)胞分化為 Th1、Th2、Th17 等亞群，承擔(dān)獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)功能；CD8+ T 細(xì)胞則分化為細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞，直接殺死靶細(xì)胞。另一部分子代細(xì)胞會(huì)分化為記憶 T 細(xì)胞，在后續(xù)的病原體再感染中提供快速且有效的免疫反應(yīng)[2]。
Section.02
誘導(dǎo) T 細(xì)胞活化的方法
T 細(xì)胞激活也可以通過化學(xué)途徑或抗體途徑實(shí)現(xiàn)。使用 CD3/CD28 抗體激活 T 細(xì)胞可以模擬體內(nèi)自然的免疫反應(yīng)，適合研究抗原特異性 T 細(xì)胞反應(yīng)。通過 PMA/Ionomycin 化學(xué)途徑能夠快速誘導(dǎo) T 細(xì)胞激活，但是可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生非特異性毒性。
抗 CD3ε 抗體能夠特異性結(jié)合 CD3ε 鏈，模擬抗原呈遞細(xì)胞 (APC) 與 TCR 的相互作用，激活 T 細(xì)胞。抗 CD28 抗體可以分為超激動(dòng)型、常規(guī)抗型、調(diào)節(jié)型以及單價(jià)抗 CD28 抗體。
圖 2. PMA/Ionomycin 誘導(dǎo) T 細(xì)胞活化的通路。
PMA 激活 PKC 和 Ras 信號(hào)通路，Ionomycin 誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子含量升高，兩者通過協(xié)同作用激活 AKT 信號(hào)通路，非 TCR 依賴性地誘導(dǎo) T 細(xì)胞激活。
表 1. PMA/Ionomycin 和 CD3/CD28 抗體激活 T 細(xì)胞的作用機(jī)制和激活效果的比較[5]。
CD3/CD28 抗體誘導(dǎo) T 細(xì)胞活化[5]:
1. 細(xì)胞提取
(1) 使用 C57BL/6 小鼠的脾臟作為細(xì)胞來源，將其研磨為單細(xì)胞懸液，用濾網(wǎng)過濾去除組織碎片。
(2) 使用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，獲得富集的白細(xì)胞并重懸。
2. 細(xì)胞分選
(1) 選擇合適的小鼠 CD3/CD8 細(xì)胞分選試劑盒，按照試劑盒說明書標(biāo)記小鼠的 CD3+ 和 CD8+ T 細(xì)胞，并通過磁性分離珠分離目標(biāo)細(xì)胞。
(2) 可用流式細(xì)胞術(shù)鑒定分選后的細(xì)胞，確保細(xì)胞純度在 95% 以上。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)
分選后的 T 細(xì)胞在 37 ℃、5% CO2 的條件下，培養(yǎng)在含有 2 mM Glutamine，10% FBS 和 penicillin-streptomycin 的完全培養(yǎng)基 RPMI 1640 中。
4. 抗 CD3ε 抗體和抗 CD28 抗體刺激活化
(1) 在 96 孔板中預(yù)先包被抗 CD3ε 抗體 (如 145-2C11) 和抗 CD28 抗體 (如 PV-1)，濃度分別為 3 µg/mL 和 1 µg/mL。
(2) 分選后的 T 細(xì)胞以 1×105 細(xì)胞/孔的密度接種于 96 孔板中，每孔 200 μL 完全培養(yǎng)基。
(3) 將分選后的 T 細(xì)胞與包被好的抗體在 37 ℃、5% CO2 的條件下共孵育 24 小時(shí)。
收集細(xì)胞并用 PBS 洗滌。
通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì) T 細(xì)胞活化進(jìn)行檢測。
PMA/Ionomycin 誘導(dǎo) T 細(xì)胞活化[5]:
細(xì)胞提取、分選和培養(yǎng)的具體步驟如上文 CD3/CD28 抗體誘導(dǎo) T 細(xì)胞活化 1-3 所示。
4. PMA/Ionomycin 刺激活化
(1) 分選后的 T 細(xì)胞以 2×105 細(xì)胞/孔的密度接種于 96 孔板中，每孔 200 μL 完全培養(yǎng)基。
(2) 分別向培養(yǎng)基中加入 50 ng/mL、100 ng/mL 和 500 ng/mL 的 PMA，和 100 ng/mL Ionomycin。
(3) 設(shè)置空白對(duì)照組，僅加入完全培養(yǎng)基而不添加 PMA/Ionomycin。
(4) 細(xì)胞在 PMA/Ionomycin 刺激下在 37 ℃、5% CO2 的條件下培養(yǎng) 24 小時(shí)。
(5) 收集細(xì)胞并用 PBS 洗滌。
(6) 使用固定活性染料標(biāo)記死細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì) T 細(xì)胞活化進(jìn)行檢測。
注意事項(xiàng)[5][6]：
1. T 細(xì)胞活化實(shí)驗(yàn)通常使用小鼠脾臟 T 細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞或人外周血單個(gè)核細(xì)胞 (PBMC)。PBMC 分離純化的詳細(xì)步驟可參考：公眾號(hào)推文鏈接 (誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化)
2. 紅細(xì)胞裂解步驟可根據(jù)所用裂解液的不同調(diào)整用量及時(shí)間。
3. 細(xì)胞分選后，確保目的細(xì)胞的純度在 95% 以上，避免非目的細(xì)胞造成干擾。
4. 細(xì)胞孵育過程中可加入 IL-2，以確保 T 細(xì)胞的存活。短期培養(yǎng) (<7 天) 時(shí)可以不添加外源性 IL-2。
5. 在抗體刺激法中可以使用抗 CD3/CD28 磁珠替代 CD3 抗體和 CD28 抗體。按照 1:1 的比例混合磁珠和細(xì)胞混合液。誘導(dǎo)完成后使用磁力架去除磁珠。
6. 以上步驟是基于文獻(xiàn)整理的實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)際操作建議根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)室條件和實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整。
T 細(xì)胞活化的鑒定[1][7][8]
T 細(xì)胞活化在早期 (通常為激活的第一個(gè) 24 小時(shí)) 的表現(xiàn)為 CD25、CD38、CD69、CD154、HLA-DR 和 ICOS 表達(dá)的上調(diào)，和 CD127 表達(dá)的下調(diào)。
長時(shí)間的持續(xù)刺激導(dǎo)致 T 細(xì)胞進(jìn)入功能耗竭狀態(tài) (通常為激活的 96 小時(shí))，PD-1、CTLA-4 和 TIM-3 表達(dá)提高，細(xì)胞因子如 IL-2、IFN-γ 和 TNF-α 的分泌減少。這些蛋白是 T 細(xì)胞耗竭的標(biāo)志物，是細(xì)胞程序性死亡蛋白或具有抑制 T 細(xì)胞活化和增殖的作用。
圖 3. T 細(xì)胞活化導(dǎo)致細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白的變化[9]。
髓系白血病細(xì)胞通過共刺激分子誘導(dǎo) T 細(xì)胞激活，但長時(shí)間的刺激最終導(dǎo)致 T 細(xì)胞功能耗竭。這種耗竭狀態(tài)通過抑制性受體的上調(diào)和細(xì)胞因子分泌的減少來體現(xiàn)。T 細(xì)胞激活導(dǎo)致 CD25、CD69、ICOS 和 CTLA-4 表達(dá)升高，CD127 表達(dá)降低；T 細(xì)胞耗竭時(shí) CD127 和 CD69 表達(dá)減少，PD-1、TIM-3 和 LAG3 表達(dá)提高。
T 細(xì)胞被激活后，可以增殖分化為效應(yīng) T 細(xì)胞 CD4+ T 細(xì)胞和 CD8+ T 細(xì)胞。CD4+ T 細(xì)胞可以分化為多種亞型，如 Th1、Th2、Th17 和 Tfh 細(xì)胞等，它們分泌細(xì)胞因子 IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ 和 TNF-α，參與免疫調(diào)節(jié)，同時(shí)輔助其他免疫細(xì)胞。CD8+ T 細(xì)胞通過釋放具有細(xì)胞毒性的穿孔素 (perforin) 和顆粒酶 (granzymes) 直接殺死靶細(xì)胞。
通過流式細(xì)胞術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)，可以定量檢測上述蛋白和分泌因子的表達(dá)，從而監(jiān)控 T 細(xì)胞活化的過程。
表 2. T 細(xì)胞激活后的 24 小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞表面標(biāo)志物和分泌的細(xì)胞因子的表達(dá)量變化[7][8][9]。
[1] Chi H, et al., Principles and therapeutic applications of adaptive immunity. Cell. 2024 Apr 25;187(9):2052-2078.
[2] Menon AP, et al., Modulating T Cell Responses by Targeting CD3. Cancers (Basel). 2023 Feb 13;15(4):1189.
[3] Poirier N, et al., CD28-specific immunomodulating antibodies: what can be learned from experimental models? Am J Transplant. 2012 Jul;12(7):1682-90.
[4] Wong W K, et al. Engineering advanced dynamic biomaterials to optimize adoptive T-cell immunotherapy[J]. Engineered Regeneration, 2021, 2: 70-81.
[5] Gao R, et al., Protein phosphatase 2A catalytic subunit β suppresses PMA/ionomycin-induced T-cell activation by negatively regulating PI3K/Akt signaling. FEBS J. 2022 Aug;289(15):4518-4535.
[6] Trickett A, et al., T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol Methods. 2003 Apr 1;275(1-2):251-5.
[7] De Biasi S, et al., Marked T cell activation, senescence, exhaustion and skewing towards TH17 in patients with COVID-19 pneumonia. Nat Commun. 2020 Jul 6;11(1):3434.
[8] Rha MS, et al., Activation or exhaustion of CD8+ T cells in patients with COVID-19. Cell Mol Immunol. 2021 Oct;18(10):2325-2333.
[9] Ozkazanc D, et al., Functional exhaustion of CD4+ T cells induced by co-stimulatory signals from myeloid leukaemia cells. Immunology. 2016 Dec;149(4):460-471.
Section.01
T 細(xì)胞激活的機(jī)制
T 細(xì)胞的活化需要兩種信號(hào)的共同參與。
第一信號(hào)是 TCR-CD3 的復(fù)合物，其傳導(dǎo)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間決定了 T 細(xì)胞的激活程度，其中 TCR 特異性地識(shí)別抗原肽-MHC 復(fù)合物，CD3 將識(shí)別的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)部。研究表明，通過調(diào)節(jié) CD3 的信號(hào)傳導(dǎo)，可以增強(qiáng)或抑制 T 細(xì)胞的免疫反應(yīng)。例如，CD3 抗體 (如 OKT3) 能夠識(shí)別 TCR-CD3 復(fù)合體上 CD3 分子的 ε 鏈，模擬抗原-MHC 的作用，直接激活 T 細(xì)胞，調(diào)節(jié) T 細(xì)胞的增殖[1][2]。
T 細(xì)胞激活還需要第二信號(hào)，即共刺激信號(hào)。最常見的共刺激分子是 CD28，它可以和樹突狀細(xì)胞表面的 B7 分子結(jié)合，共同促進(jìn) T 細(xì)胞的激活過程，并且增強(qiáng) T 細(xì)胞的增殖和分化。CD28 抗體可以通過不同的機(jī)制激活或抑制 T 細(xì)胞活性，為免疫調(diào)節(jié)提供了重要工具[3]。
在這場 "免疫交響曲" 中，樹突狀細(xì)胞不僅是抗原呈遞的 "指揮官"，還是細(xì)胞因子的 "生產(chǎn)者"。樹突狀細(xì)胞可以分泌細(xì)胞因子，如 IL-2、IL-12，進(jìn)一步誘導(dǎo) T 細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo) CD4+ T 細(xì)胞分化，增加 CD8+ T 細(xì)胞的細(xì)胞毒性，支持免疫記憶細(xì)胞的形成。
圖 1. T 細(xì)胞激活的主要信號(hào)[4]。信號(hào) 1：TCR 與 CD3 結(jié)合，傳遞 pMHC 信號(hào)；信號(hào) 2：共刺激信號(hào) CD28 與 B7 分子（CD80/86）結(jié)合，促進(jìn) T 細(xì)胞的增殖和激活；信號(hào) 3：細(xì)胞因子，如 IL-2 和 IL-12，調(diào)節(jié) T 細(xì)胞的增殖和分化。
當(dāng) T 細(xì)胞被激活后，它們會(huì)退出靜止?fàn)顟B(tài)，進(jìn)入快速的克隆擴(kuò)增階段。被激活的 T 細(xì)胞會(huì)多次分裂，產(chǎn)生大量具有相同 TCR 的子代細(xì)胞。這些子代細(xì)胞將進(jìn)一步分化為效應(yīng) T 細(xì)胞和記憶 T 細(xì)胞。效應(yīng) T 細(xì)胞如 CD4+ T 細(xì)胞分化為 Th1、Th2、Th17 等亞群，承擔(dān)獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)功能；CD8+ T 細(xì)胞則分化為細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞，直接殺死靶細(xì)胞。另一部分子代細(xì)胞會(huì)分化為記憶 T 細(xì)胞，在后續(xù)的病原體再感染中提供快速且有效的免疫反應(yīng)[2]。
Section.02
誘導(dǎo) T 細(xì)胞活化的方法
T 細(xì)胞激活也可以通過化學(xué)途徑或抗體途徑實(shí)現(xiàn)。使用 CD3/CD28 抗體激活 T 細(xì)胞可以模擬體內(nèi)自然的免疫反應(yīng)，適合研究抗原特異性 T 細(xì)胞反應(yīng)。通過 PMA/Ionomycin 化學(xué)途徑能夠快速誘導(dǎo) T 細(xì)胞激活，但是可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生非特異性毒性。
抗 CD3ε 抗體能夠特異性結(jié)合 CD3ε 鏈，模擬抗原呈遞細(xì)胞 (APC) 與 TCR 的相互作用，激活 T 細(xì)胞。抗 CD28 抗體可以分為超激動(dòng)型、常規(guī)抗型、調(diào)節(jié)型以及單價(jià)抗 CD28 抗體。
- 常規(guī)型抗 CD28 抗體 (如 37.51) 可以結(jié)合 CD28 的其他表位，部分阻斷 CD28/B7 的相互作用，與 TCR 信號(hào)協(xié)同作用來共刺激 T 細(xì)胞。
- 超激動(dòng)型抗 CD28 抗體 (如 D665) 結(jié)合 CD28 的側(cè)向暴露的 C''D 環(huán)，能夠多聚化 CD28 分子而不阻斷 CD28/B7 的相互作用，且不依賴于 TCR 信號(hào)通路地激活 T 細(xì)胞。
- 調(diào)節(jié)型抗 CD28 抗體 (如 JJ319) 可以下調(diào) CD28 的表達(dá)來調(diào)節(jié) T 細(xì)胞的活化，它們能夠在體外共刺激 T 細(xì)胞，在體內(nèi)通過下調(diào) CD28 表達(dá)來抑制 T 細(xì)胞的活化。
- 而單價(jià)抗 CD28 抗體可以結(jié)合 CD28 的單個(gè)表位，阻斷 CD28/B7 的相互作用，但不通過多聚化 CD28 分子來激活 T 細(xì)胞，在體外和體內(nèi)表現(xiàn)出拮抗作用，抑制 T 細(xì)胞的激活[2][3]。
PMA 可以模擬細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子 DAG，直接激活蛋白激酶 PKC，繞過 TCR 激活的早期步驟，直接觸發(fā)下游信號(hào)通路。Lonomycin 是一種鈣離子載體，能夠選擇性地結(jié)合鈣離子并增加細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子濃度，模擬 IP3 的作用，激活鈣調(diào)蛋白 CaM 和鈣調(diào)磷酸酶 CaN，激活 NFAT 并促進(jìn)細(xì)胞因子的表達(dá)。PMA 和 Ionomycin 的聯(lián)合作用可以促進(jìn) T 細(xì)胞活化[5]。
圖 2. PMA/Ionomycin 誘導(dǎo) T 細(xì)胞活化的通路。PMA 激活 PKC 和 Ras 信號(hào)通路，Ionomycin 誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子含量升高，兩者通過協(xié)同作用激活 AKT 信號(hào)通路，非 TCR 依賴性地誘導(dǎo) T 細(xì)胞激活。
表 1. PMA/Ionomycin 和 CD3/CD28 抗體激活 T 細(xì)胞的作用機(jī)制和激活效果的比較[5]。
CD3/CD28 抗體誘導(dǎo) T 細(xì)胞活化[5]:
1. 細(xì)胞提取
(1) 使用 C57BL/6 小鼠的脾臟作為細(xì)胞來源，將其研磨為單細(xì)胞懸液，用濾網(wǎng)過濾去除組織碎片。
(2) 使用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，獲得富集的白細(xì)胞并重懸。
2. 細(xì)胞分選
(1) 選擇合適的小鼠 CD3/CD8 細(xì)胞分選試劑盒，按照試劑盒說明書標(biāo)記小鼠的 CD3+ 和 CD8+ T 細(xì)胞，并通過磁性分離珠分離目標(biāo)細(xì)胞。
(2) 可用流式細(xì)胞術(shù)鑒定分選后的細(xì)胞，確保細(xì)胞純度在 95% 以上。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)
分選后的 T 細(xì)胞在 37 ℃、5% CO2 的條件下，培養(yǎng)在含有 2 mM Glutamine，10% FBS 和 penicillin-streptomycin 的完全培養(yǎng)基 RPMI 1640 中。
4. 抗 CD3ε 抗體和抗 CD28 抗體刺激活化
(1) 在 96 孔板中預(yù)先包被抗 CD3ε 抗體 (如 145-2C11) 和抗 CD28 抗體 (如 PV-1)，濃度分別為 3 µg/mL 和 1 µg/mL。
(2) 分選后的 T 細(xì)胞以 1×105 細(xì)胞/孔的密度接種于 96 孔板中，每孔 200 μL 完全培養(yǎng)基。
(3) 將分選后的 T 細(xì)胞與包被好的抗體在 37 ℃、5% CO2 的條件下共孵育 24 小時(shí)。
收集細(xì)胞并用 PBS 洗滌。
通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì) T 細(xì)胞活化進(jìn)行檢測。
PMA/Ionomycin 誘導(dǎo) T 細(xì)胞活化[5]:
細(xì)胞提取、分選和培養(yǎng)的具體步驟如上文 CD3/CD28 抗體誘導(dǎo) T 細(xì)胞活化 1-3 所示。
4. PMA/Ionomycin 刺激活化
(1) 分選后的 T 細(xì)胞以 2×105 細(xì)胞/孔的密度接種于 96 孔板中，每孔 200 μL 完全培養(yǎng)基。
(2) 分別向培養(yǎng)基中加入 50 ng/mL、100 ng/mL 和 500 ng/mL 的 PMA，和 100 ng/mL Ionomycin。
(3) 設(shè)置空白對(duì)照組，僅加入完全培養(yǎng)基而不添加 PMA/Ionomycin。
(4) 細(xì)胞在 PMA/Ionomycin 刺激下在 37 ℃、5% CO2 的條件下培養(yǎng) 24 小時(shí)。
(5) 收集細(xì)胞并用 PBS 洗滌。
(6) 使用固定活性染料標(biāo)記死細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì) T 細(xì)胞活化進(jìn)行檢測。
注意事項(xiàng)[5][6]：
1. T 細(xì)胞活化實(shí)驗(yàn)通常使用小鼠脾臟 T 細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞或人外周血單個(gè)核細(xì)胞 (PBMC)。PBMC 分離純化的詳細(xì)步驟可參考：公眾號(hào)推文鏈接 (誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化)
2. 紅細(xì)胞裂解步驟可根據(jù)所用裂解液的不同調(diào)整用量及時(shí)間。
3. 細(xì)胞分選后，確保目的細(xì)胞的純度在 95% 以上，避免非目的細(xì)胞造成干擾。
4. 細(xì)胞孵育過程中可加入 IL-2，以確保 T 細(xì)胞的存活。短期培養(yǎng) (<7 天) 時(shí)可以不添加外源性 IL-2。
5. 在抗體刺激法中可以使用抗 CD3/CD28 磁珠替代 CD3 抗體和 CD28 抗體。按照 1:1 的比例混合磁珠和細(xì)胞混合液。誘導(dǎo)完成后使用磁力架去除磁珠。
6. 以上步驟是基于文獻(xiàn)整理的實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)際操作建議根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)室條件和實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整。
T 細(xì)胞活化的鑒定[1][7][8]
T 細(xì)胞活化在早期 (通常為激活的第一個(gè) 24 小時(shí)) 的表現(xiàn)為 CD25、CD38、CD69、CD154、HLA-DR 和 ICOS 表達(dá)的上調(diào)，和 CD127 表達(dá)的下調(diào)。
長時(shí)間的持續(xù)刺激導(dǎo)致 T 細(xì)胞進(jìn)入功能耗竭狀態(tài) (通常為激活的 96 小時(shí))，PD-1、CTLA-4 和 TIM-3 表達(dá)提高，細(xì)胞因子如 IL-2、IFN-γ 和 TNF-α 的分泌減少。這些蛋白是 T 細(xì)胞耗竭的標(biāo)志物，是細(xì)胞程序性死亡蛋白或具有抑制 T 細(xì)胞活化和增殖的作用。
圖 3. T 細(xì)胞活化導(dǎo)致細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白的變化[9]。髓系白血病細(xì)胞通過共刺激分子誘導(dǎo) T 細(xì)胞激活，但長時(shí)間的刺激最終導(dǎo)致 T 細(xì)胞功能耗竭。這種耗竭狀態(tài)通過抑制性受體的上調(diào)和細(xì)胞因子分泌的減少來體現(xiàn)。T 細(xì)胞激活導(dǎo)致 CD25、CD69、ICOS 和 CTLA-4 表達(dá)升高，CD127 表達(dá)降低；T 細(xì)胞耗竭時(shí) CD127 和 CD69 表達(dá)減少，PD-1、TIM-3 和 LAG3 表達(dá)提高。
T 細(xì)胞被激活后，可以增殖分化為效應(yīng) T 細(xì)胞 CD4+ T 細(xì)胞和 CD8+ T 細(xì)胞。CD4+ T 細(xì)胞可以分化為多種亞型，如 Th1、Th2、Th17 和 Tfh 細(xì)胞等，它們分泌細(xì)胞因子 IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ 和 TNF-α，參與免疫調(diào)節(jié)，同時(shí)輔助其他免疫細(xì)胞。CD8+ T 細(xì)胞通過釋放具有細(xì)胞毒性的穿孔素 (perforin) 和顆粒酶 (granzymes) 直接殺死靶細(xì)胞。
通過流式細(xì)胞術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)，可以定量檢測上述蛋白和分泌因子的表達(dá)，從而監(jiān)控 T 細(xì)胞活化的過程。
表 2. T 細(xì)胞激活后的 24 小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞表面標(biāo)志物和分泌的細(xì)胞因子的表達(dá)量變化[7][8][9]。
| 產(chǎn)品推薦 |
| 145-2C11，anti-mouse CD3 抗體，模擬 pMHC 激活 T 細(xì)胞 |
| 17A2，anti-mouse CD3 抗體，施加外力的情況下可以激活 T 細(xì)胞 |
| JJ316，anti-rat CD28 抗體，無需 TCR 配體，可在體內(nèi)/體外激活 T 細(xì)胞 |
| 抗 CD3/CD28 磁珠 人 CD3/CD28 磁珠，可用于人 T 細(xì)胞激活 |
| CD25 可用于流式細(xì)胞術(shù)、ELISA 檢測 HLA-DR 可用于流式細(xì)胞術(shù)檢測 |
| IL-2 可用于流式細(xì)胞術(shù)、ELISA 檢測 |
| IL-17 可用于 ELISA 檢測 |
| IFN-γ 可用于流式細(xì)胞術(shù)檢測 |
| TNF-α 可用于 ELISA 檢測 |
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