利用WGBS繪制11種實(shí)體瘤DNA甲基化單體圖譜

近日，中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心石建濤研究員與上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院方海研究員合作，通過(guò)全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）技術(shù)繪制了11種常見(jiàn)實(shí)體瘤的DNA甲基化單體圖譜（DNA methylation haplotype map）。研究團(tuán)隊(duì)對(duì)110個(gè)原發(fā)性腫瘤樣本的全基因組DNA甲基化數(shù)據(jù)（WGBS）進(jìn)行深度分析，共鑒定出81,567個(gè)非冗余的DNA甲基化單體水平上的共甲基化區(qū)域，稱為DNA甲基化單體區(qū)塊（Methylation Haplotype Blocks, MHBs），這些MHBs在癌癥類型中表現(xiàn)出高度特異性，并與基因表達(dá)調(diào)控、致癌通路密切相關(guān)，為癌癥檢測(cè)提供了新的生物標(biāo)志物。相關(guān)研究成果以“Toward the DNA methylation haplotype map of 11 common solid cancers”為題發(fā)表于《Cell Reports》期刊。
 

標(biāo)題：Toward the DNA methylation haplotype map of 11 common solid cancers（11種常見(jiàn)實(shí)體癌的DNA甲基化單體圖譜）
發(fā)表時(shí)間：2025.08.23
發(fā)表期刊：Cell Reports
影響因子：IF6.9/Q1
技術(shù)平臺(tái)：WGBS
作者單位：中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心石建濤、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院方海等
DOI：10.1016/j.celrep.2025.116197

在異質(zhì)性腫瘤中，相鄰的CpG位點(diǎn)會(huì)形成甲基化單體區(qū)塊（MHBs），MHBs與基因表達(dá)失調(diào)有關(guān)，但其在泛癌中的動(dòng)態(tài)變化特征和臨床意義仍然未知。研究人員對(duì)11種常見(jiàn)實(shí)體瘤的110個(gè)原發(fā)性腫瘤樣本進(jìn)行DNA甲基化分析，共鑒定出81,567個(gè)MHBs。這些MHBs呈現(xiàn)高度的癌癥類型特異性，并富集于基因調(diào)控元件。整合的bulk和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示了MHBs與基因表達(dá)的相關(guān)性且和平均甲基化水平變化無(wú)關(guān)。此外，泛癌分析揭示了與MHBs相關(guān)的差異表達(dá)基因在致癌通路（如G2/M檢查點(diǎn)、MYC靶點(diǎn)和E2F信號(hào)）中的重要作用。最后研究驗(yàn)證了MHBs可以作為癌癥檢測(cè)的有效生物標(biāo)志物。本研究將MHBs確立為多模態(tài)表觀遺傳調(diào)控因子，可連接腫瘤異質(zhì)性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和液體活檢等診斷領(lǐng)域。

研究亮點(diǎn)

• 對(duì)110個(gè)實(shí)體瘤進(jìn)行DNA甲基化測(cè)序，鑒定出81,567個(gè)MHBs。
• MHBs與不依賴于基因表達(dá)的甲基化水平變化相關(guān)。
• 與MHBs相關(guān)的基因在癌癥中失調(diào)，并在致癌通路中富集。
• 腫瘤間異質(zhì)性分析將甲基化差異與介導(dǎo)突變相關(guān)聯(lián)。

研究摘要

• 樣本收集：研究團(tuán)隊(duì)收集了110個(gè)原發(fā)性腫瘤樣本，涵蓋11種常見(jiàn)的實(shí)體瘤類型，包括頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSC）、甲狀腺癌（THCA）、非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）、乳腺癌（BRCA）、食管癌（ESCA）、肝細(xì)胞癌（LIHC）、胃腺癌（STAD）、胰腺癌（PACA）、結(jié)腸腺癌（COAD）、卵巢漿液性腺癌（OV）和宮頸癌及子宮頸癌（CESC）。
• WGBS測(cè)序分析：對(duì)片段化的DNA進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化處理，構(gòu)建WGBS文庫(kù)并測(cè)序，對(duì)WGBS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析鑒定出MHBs。
• 外部數(shù)據(jù)收集與驗(yàn)證：研究團(tuán)隊(duì)收集多個(gè)公共WGBS和RRBS數(shù)據(jù)集，用于驗(yàn)證鑒定出的MHBs，并評(píng)估其在不同癌癥類型中的特異性和共性。

圖1：癌癥中MHBs的鑒定

1. 本研究中包含的癌癥類型。標(biāo)注各癌癥類型縮寫(xiě)和WGBS樣本數(shù)量。
2. 結(jié)腸癌中的代表性MHBs。上：?jiǎn)蝹�(gè)片段的DNA甲基化狀態(tài)（黑：甲基化CpG位點(diǎn)；白：未甲基化CpG位點(diǎn)）。中：相鄰CpG位點(diǎn)之間的平均LD R2。下：CpG位點(diǎn)間的成對(duì)LD R2。
3. 每種癌癥類型中鑒定出的MHBs數(shù)量。
4. 餅圖展示MHB在基因組在啟動(dòng)子、外顯子、內(nèi)含子和基因間區(qū)域的注釋比例。
5. 內(nèi)部樣本、新鮮冷凍組織和公共腫瘤數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)中的MHBs分配到16個(gè)非重疊簇中進(jìn)行聚類分析。
6. 癌癥特異性MHB簇在相應(yīng)正常組織中的富集分析。

圖2：癌癥MHBs在開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域的富集

1. 癌癥MHBs與匹配癌癥類型中的開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域的重疊分析。
2. MHBs在DNA甲基化狀態(tài)區(qū)域的注釋，包括未甲基化區(qū)域(UMRs)、低甲基化區(qū)域(LMRs)、部分甲基化區(qū)域(PMDs)和高甲基化區(qū)域(HMRs)。

(C-D) MHBs在LMRs和PMDs中的富集分析。
(E) 當(dāng)調(diào)控平均甲基化水平的情況下，含有MHBs的基因組區(qū)域在開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域中更富集。
(F) MHBs在疾病狀態(tài)特異性ChIA-PET數(shù)據(jù)中的富集分析。

（3）癌癥MHBs與基因表達(dá)失調(diào)相關(guān)
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)整合分析，發(fā)現(xiàn)MHBs與基因表達(dá)的相關(guān)性不依賴于平均甲基化水平的變化，超過(guò)50%的MHBs與差異甲基化區(qū)域（DMRs）重疊。在食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）中，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)排除DMRs相關(guān)基因后，含有MHBs的基因更有可能上調(diào)表達(dá)。

通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析（CollecTRI數(shù)據(jù)庫(kù)），鑒定出52個(gè)在ESCC中活性顯著改變的調(diào)控因子，包括MYC、HIF1A、E2F家族等，這些因子在G2/M檢查點(diǎn)和WNT通路中富集。WGBS的讀長(zhǎng)水平數(shù)據(jù)（read-level data）揭示了甲基化單體（mHaps）與基因表達(dá)的獨(dú)立關(guān)聯(lián)，突破了傳統(tǒng)平均甲基化分析的局限性。

圖3：癌癥MHBs與基因表達(dá)失調(diào)相關(guān)

1. MHBs注釋到DMRs。Hyper，高甲基化DMR；Hypo，低甲基化DMR；NC，無(wú)顯著變化；ND，未確定。

(B-C) MHBs在高甲基化和低甲基化DMRs中的富集分析。
(D) ESCC中MHBs與基因表達(dá)失調(diào)的關(guān)聯(lián)分析。ESCC數(shù)據(jù)集（GSE149612）包含10個(gè)腫瘤和匹配的10個(gè)正常WGBS和RNA-seq樣本的，ESCC MHBs（n=27,497），ESCC與鄰近正常組織間的DEGs（n=2,769）。
(E) 熱圖顯示含有MHBs的上調(diào)基因平均甲基化和表達(dá)情況。
(F) 熱圖顯示ESCC和正常食管組織之間的轉(zhuǎn)錄因子（TF）活性。
(G) ESCC TE5細(xì)胞系的ChIP-seq數(shù)據(jù)的KLF5結(jié)合譜。MHB區(qū)域分為ESCC腫瘤特異性（n=20,778）、正常特異性（n=10,501）或共有（n=7,368）。

（4）利用單細(xì)胞數(shù)據(jù)驗(yàn)證結(jié)腸癌MHBs
研究團(tuán)隊(duì)利用單細(xì)胞甲基化測(cè)序（scBS-seq）數(shù)據(jù)，驗(yàn)證了結(jié)腸癌MHBs的調(diào)控作用。在單細(xì)胞水平上，MHBs在不同類型的惡性細(xì)胞中表現(xiàn)出顯著的一致性，表明這些MHBs在結(jié)腸癌中具有優(yōu)異的調(diào)控作用。此外，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)含有MHBs的基因在單細(xì)胞中表現(xiàn)出更高的表達(dá)水平，進(jìn)一步證實(shí)了MHBs在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。

圖4：利用單細(xì)胞數(shù)據(jù)驗(yàn)證癌癥MHBs及其調(diào)控作用

（A）單細(xì)胞DNA甲基化單體（sc-mHap）示意圖。上：CpG平均甲基化二元分類（甲基化>0.9；未甲基化<0.1）生成sc-mHaps。下：15個(gè)單細(xì)胞的示例mHap模式。
（B）CRC單細(xì)胞數(shù)據(jù)中鑒定出的COAD MHB示例。
（C）不同單細(xì)胞樣本類型中鑒定出的MHB重疊情況。
（D）以泛癌MHB為背景，對(duì)原發(fā)性腫瘤單細(xì)胞MHB與11種癌癥類型的bulk樣本MHB進(jìn)行富集分析。
（E）基因表達(dá)與啟動(dòng)子區(qū)域MHBs的相關(guān)性。每個(gè)單細(xì)胞根據(jù)平均甲基化水平將啟動(dòng)子分為三組：高甲基化（>0.8）、中等甲基化（0.2–0.8）和低甲基化（<0.2）。組內(nèi)比較了含有或不含有MHBs的啟動(dòng)子對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)。
（F）中等、低甲基化啟動(dòng)子組中MHB甲基化水平對(duì)基因表達(dá)的作用。
（G）單細(xì)胞CRC中MHBs與基因表達(dá)失調(diào)的關(guān)聯(lián)。
（H）Venn圖顯示PT和LN腫瘤中上調(diào)且啟動(dòng)子區(qū)域含MHB但無(wú)DMRs的基因數(shù)量。PT：原發(fā)性腫瘤，n=581、LN：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，n=346。
（I）PT和LN中共有的42個(gè)與MHB相關(guān)基因的通路富集分析。
（J）熱圖顯示含有MHB的42個(gè)共有基因在單細(xì)胞中的平均甲基化和表達(dá)水平。在MYC靶點(diǎn)和G2/M檢查點(diǎn)通路中注釋的基因用紅色標(biāo)記。
（K）使用TCGA-COAD數(shù)據(jù)集驗(yàn)證（J）中在不同病理階段突出顯示的10個(gè)基因的DNA甲基化和基因表達(dá)譜。
（L）TCGA-COAD數(shù)據(jù)集中，按CBX3基因高/低表達(dá)對(duì)患者亞組進(jìn)行分層，比較無(wú)病生存（DFS）的Kaplan-Meier生存曲線。

（5）泛癌MHBs與差異表達(dá)基因相關(guān)
研究人員通過(guò)整合TCGA多組學(xué)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，MHBs與11種癌癥中DEGs顯著相關(guān)，無(wú)論有或沒(méi)有DMRs基因。通過(guò)優(yōu)先級(jí)指數(shù)（Priority Index, Pi）分析，研究團(tuán)隊(duì)篩選出8,852個(gè)泛癌MHB靶基因，其中53個(gè)基因構(gòu)成通路交叉網(wǎng)絡(luò)，包括MYC靶點(diǎn)、G2/M檢查點(diǎn)和E2F通路等關(guān)鍵致癌通路。

圖5：癌癥MHBs與泛癌中差異表達(dá)基因相關(guān)

1. 癌癥MHB相關(guān)基因在差異表達(dá)基因中的富集分析。森林圖顯示癌癥MHB相關(guān)基因（排除DMR相關(guān)基因）在DEGs中的富集。
2. 泛癌MHB相關(guān)基因的通路富集分析。篩選出六種以上癌癥類型共有的MHB相關(guān)基因。上：共有上調(diào)基因的基因集富集。下：在G2/M檢查點(diǎn)或MYC活性通路中被注釋選定基因在不同癌癥類型中的甲基化和表達(dá)譜差異。
3. 泛癌通路交叉分析。
4. 在TCGA數(shù)據(jù)集的CESC、LIHC、LUAD和PAAD中，根據(jù)RRM2和SLC2A1基因高/低表達(dá)對(duì)患者亞組進(jìn)行分層，比較總生存率的Kaplan-Meier生存曲線。

圖6：癌癥中DNA甲基化腫瘤間異質(zhì)性表征

1. 箱線圖顯示TCGA 450K甲基化芯片數(shù)據(jù)中成對(duì)CpG位點(diǎn)平均甲基化的皮爾遜相關(guān)系數(shù)。分析區(qū)域包括：泛癌MHBs（所有癌癥類型聯(lián)合MHBs）、癌癥類型特異性MHBs、CpG島（CGI）和隨機(jī)基因組區(qū)域。
2. 一致性甲基化水平的定量分析。以COAD為例，使用LOESS曲線擬合MHBs與隨機(jī)區(qū)域之間的平均甲基化和方差。AUC量化一致性（AUC值越低，一致性越高）。
3. 低AUC和高AUC腫瘤之間的DEGs數(shù)量。紅色表示上調(diào)；藍(lán)色表示下調(diào)。
4. 上調(diào)DEGs中富集的通路（來(lái)自MSigDB的標(biāo)志性通路）。
5. AUC分析驅(qū)動(dòng)突變與一致性甲基化水平之間的相關(guān)性火山圖。紅色：AUC升高；藍(lán)色：AUC降低。
6. 箱線圖顯示IDH1突變與TCGA數(shù)據(jù)集中甲基化一致性顯著相關(guān)。
7. IDH1突變效應(yīng)的獨(dú)立驗(yàn)證（GSE50774）。

圖7：基于癌癥MHB的血漿DNA非侵入性癌癥檢測(cè)

1. 作為癌癥檢測(cè)生物標(biāo)志物的MHB區(qū)域。從癌癥MHB中鑒定出的通用癌癥標(biāo)志物，展示腫瘤和正常樣本中16種k-mers頻率分布。
2. 隨機(jī)森林模型對(duì)基于血漿DNA中MHL、MBS和CpG位點(diǎn)的平均甲基化水平進(jìn)行的癌癥性能檢測(cè)。通過(guò)5折交叉驗(yàn)證比較結(jié)直腸癌（CRC）、食管鱗癌（ESCC）、肝細(xì)胞癌（HCC）、胃癌（GC）、食管腺癌（EAC）和胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）與正常樣本的受試者工作特征（ROC）曲線及曲線下面積（AUC）值。

結(jié)論和啟示
本研究通過(guò)WGBS技術(shù)，揭示了11種常見(jiàn)實(shí)體瘤中MHBs的特征和功能。研究結(jié)果表明，MHBs作為細(xì)胞身份的特征，不僅具有組織特異性，還具備疾病狀態(tài)特異性。MHBs在開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域中富集，表明其在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。MHBs與基因表達(dá)顯著相關(guān)且不依賴于平均甲基化水平變化，這一發(fā)現(xiàn)通過(guò)單細(xì)胞數(shù)據(jù)得到進(jìn)一步驗(yàn)證。在臨床應(yīng)用方面，MHBs作為生物標(biāo)志物在非侵入性癌癥檢測(cè)中表現(xiàn)出優(yōu)越的性能，為早期癌癥檢測(cè)提供了新的工具。

WGBS技術(shù)在本研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，使得研究團(tuán)隊(duì)能夠以單堿基分辨率分析DNA甲基化模式，鑒定出與癌癥發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的MHBs。未來(lái)的研究可以利用WGBS技術(shù)進(jìn)一步探索其他癌癥類型中的DNA甲基化圖譜，開(kāi)發(fā)更多基于表觀遺傳學(xué)的癌癥診斷和治療策略。

參考文獻(xiàn)：
Zhang Z, Hong Y, Zhang S, Zhu X, Liu L, Liao X, Gu H, Fang H, Shi J. Toward the DNA methylation haplotype map of 11 common solid cancers. Cell Rep. 2025 Aug 23;44(9):116197. doi: 10.1016/j.celrep.2025.116197.