Cell Meter PE Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒使用說明書

Cell Meter PE Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒概述
 
Cell Meter  PE-Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒是美國AAT Bioquest生產(chǎn)的用于檢測細胞凋亡的試劑盒，膜聯(lián)蛋白V可以與包括PE的熒光染料結(jié)合。該染料保留了其對磷脂酰絲氨酸（PS）的高親和力，因此可用作流式細胞術(shù)分析正在經(jīng)歷細胞凋亡的細胞的敏感探針。由于PS的外化發(fā)生在細胞凋亡的早期階段，PE膜聯(lián)蛋白V染色可以比基于核變化（例如DNA片段化）的測定更早地鑒定細胞凋亡。 PE膜聯(lián)蛋白V染色先于膜完整性的喪失，膜完整性伴隨由凋亡或壞死過程導(dǎo)致的最新細胞死亡階段。因此，用PE膜聯(lián)蛋白V染色通常與碘化丙啶（PI）或7-氨基 - 放線菌素（7-AAD）等活體染料結(jié)合使用，使研究者能夠鑒別早期凋亡細胞（7-AAD陰性，PE膜聯(lián)蛋白V陽性）。具有完整膜的存活細胞排除7-AAD，而死亡和受損細胞的膜可透過7-AAD。例如，被認為存活的細胞既是PE膜聯(lián)蛋白V也是7-AAD陰性的，而處于早期凋亡的細胞是PE膜聯(lián)蛋白V陽性和7-AAD陰性，而處于晚期凋亡或已經(jīng)死亡的細胞都是PE膜聯(lián)蛋白V和7-AAD陽性。該測定法不區(qū)分經(jīng)歷凋亡性死亡的細胞與因壞死性通路而死亡的細胞，因為在任一情況下，死亡細胞都將用PE膜聯(lián)蛋白V和7-AAD染色。然而，當隨著時間測量細胞凋亡時，可以經(jīng)常從PE膜聯(lián)蛋白V和7-AAD陰性（可行的，或不可測量的細胞凋亡）追蹤細胞至PE膜聯(lián)蛋白V陽性和7-AAD陰性（早期凋亡，膜完整性存在），最后是PE膜聯(lián)蛋白V和7-AAD陽性（末期凋亡和死亡）。細胞通過這三個階段的運動表明細胞凋亡。

Cell Meter PE Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒適用儀器  
流式細胞儀
E  x:       488nm or 561nm
E  m:       575/26nm
通道:       PE通道

Cell Meter PE Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒實驗方案  

簡要概述
（1）用測試化合物（200μL/樣品）制備細胞
（2）添加RPE-膜聯(lián)蛋白V測定溶液
（3）在室溫下孵育20-60分鐘
（4）使用FL2通道（Ex / Em = 488/585 nm）用流式細胞儀分析細胞

儲備溶液配制
除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣，并在制備后儲存在-20°C。 避免反復(fù)凍融循環(huán)。
RPE-Annexin V原液（100X）：
將含有0.2％BSA的200μLPBS加入到RPE-膜聯(lián)蛋白V（組分A）的小瓶中以制備100X RPE-膜聯(lián)蛋白V儲備溶液。 注意：將重構(gòu)的100X RPE-Annexin V儲備溶液儲存在4°C。

操作步驟
A.用測試化合物處理細胞一段所需的時間（用星形孢菌素處理的Jurkat細胞4-6小時）以誘導(dǎo)細胞凋亡。注意：膜粘附細胞的膜聯(lián)蛋白V流式細胞術(shù)分析未經(jīng)常檢測，因為在細胞分離或收獲期間可能發(fā)生特定的膜損傷。然而，Casiola-Rosen等人先前報道了利用膜聯(lián)蛋白V對貼壁細胞類型進行流式細胞術(shù)的方法。
B.離心細胞，得到1-5×105個細胞/管。
C.將細胞重懸于200μL測定緩沖液（組分B）中。
D.向細胞中加入2μL100XRPE-膜聯(lián)蛋白V原液。
E.可選：為壞死細胞添加2μL100XNuclear Red DCS（成分C）。
F在室溫下孵育20至60分鐘，避光。
G可選：在使用流式細胞儀分析細胞之前，添加200至300μL的測定緩沖液（組分B）以增加體積。
H.使用具有FL2通道的流式細胞儀（Ex / Em = 488 / 585nm）監(jiān)測RPE-膜聯(lián)蛋白V的熒光強度。當將Nuclear Red DCS添加到細胞中時，使用FL4通道測量細胞活力。
4.百螢 Cell Meter PE Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒數(shù)據(jù)分析
在活的非凋亡細胞中，RPE-模聯(lián)蛋白V檢測非誘導(dǎo)細胞中的先天性細胞凋亡，其通常為所以細胞的2-6%。在凋亡細胞中，RPE-模聯(lián)蛋白V與磷脂酰絲氨酸結(jié)合，磷脂酰絲氨酸位于細胞膜的外葉上，因此導(dǎo)致染色強度增加。


圖1.使用Cell Meter RPE-膜聯(lián)蛋白V結(jié)合細胞凋亡檢測試劑盒檢測RPE-膜聯(lián)蛋白V對Jurkat細胞中磷脂酰絲氨酸的結(jié)合活性。 將Jurkat細胞在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中在沒有（藍色）或1μM星形孢菌素（紅色）的情況下處理4-5小時，然后用RPE-膜聯(lián)蛋白V染色30分鐘。 使用FACSCalibur（Becton Dickinson）流式細胞儀使用FL2通道測量RPE-膜聯(lián)蛋白V的熒光強度。

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