酶解聚獲得純化的細(xì)胞株的方法介紹

細(xì)胞株分離的方法有多種，常用的是機(jī)械解離細(xì)胞法、酶學(xué)解離細(xì)胞法以及螯合劑解離細(xì)胞法，下面我們就介紹酶解聚方法獲得純化的細(xì)胞株。

1、純化法
在去除不需要的組織后，使用無(wú)菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4 mm小片，通過(guò)懸浮在無(wú)鈣鎂的中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀，去除上清液。重復(fù)清洗2到3次。
將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無(wú)鈣鎂的（100 mg組織加入1ml ）。
在4℃孵育6到18小時(shí)，使幾乎沒(méi)有活性的酶盡可能滲透進(jìn)去。
移棄組織碎片中的，在37℃孵育包含殘留的組織碎片20到30分鐘。
在組織碎片加入熱的完全培養(yǎng)基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無(wú)血清培養(yǎng)基，要加入大豆抑制劑。
通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)（100～200 mm）過(guò)濾，分散所有剩余組織。計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。

2、膠原酶純化法
用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗組織碎片幾次。
加入膠原酶（50～200單位/ml，溶解在HBSS中）。
在37℃孵育4到18小時(shí)。加入3mM CaCl2增加解離效率。
通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶。
通過(guò)離心在HBSS中清洗懸液幾次。
再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。

3、Dispase純化法
用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片，用不含鈣鎂的清洗組織碎片幾次。
加入Dispase（0.6～2.4單位/ml 溶解在無(wú)鈣鎂的）
在37℃孵育20分鐘到幾個(gè)小時(shí)。
通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的Dispase。
通過(guò)離心在中清洗懸液幾次。
再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。
分離細(xì)胞后，首ci傳代需要注意的問(wèn)題：
傳代培養(yǎng)時(shí)先觀察細(xì)胞的活性。
細(xì)胞的活率應(yīng)該超過(guò)90%，密度控制在80%左右