熒光素酶的作用原理及應(yīng)用

熒光素酶（luciferase）是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的總稱。熒光素酶可以催化熒光素氧化成氧化熒光素，在熒光素氧化的過程中，會發(fā)出生物熒光。然后可以通過熒光測定儀測定熒光素氧化過程中釋放的生物熒光。熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以極其靈敏、高效地檢測基因的表達(dá)，是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種檢測方法。
目前，最有代表性的是從甲蟲中分離得到的螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和從海腎中分離得到的海腎熒光素酶（Renilla luciferase）。其中螢火蟲熒光素酶作為報告基因反應(yīng)目的基因表達(dá)的改變，腎熒光素酶作為內(nèi)參基因，為實(shí)驗(yàn)提供統(tǒng)一基準(zhǔn)線（減少內(nèi)在變化因素如培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目，細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率對實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響）。
實(shí)驗(yàn)原理
螢火蟲熒光素酶在氧氣、ATP和鎂離子同時存在的條件下，催化熒光素氧化，生成氧化熒光素，同時產(chǎn)生黃綠色光，波長540-600nm。
腎熒光素酶只需要氧氣就可以催化腔腸素氧化產(chǎn)生藍(lán)光，波長460-540nm，一般檢測時選用460nm
利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特性，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上/下游，構(gòu)建成熒光素酶報告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，適當(dāng)刺激或處理后裂解細(xì)胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調(diào)控元件的影響。
應(yīng)用類型
由于兩種酶底物和發(fā)光顏色的區(qū)別，且在動物體內(nèi)無內(nèi)源性表達(dá)，使其雙報告基因系統(tǒng)在基因調(diào)控、非編碼RNA靶向互作等研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
啟動子研究：轉(zhuǎn)錄因子主要通過作用于靶基因的啟動子起作用，將目的基因啟動子區(qū)序列替換報告基因F-Luc的啟動子，通過共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子后，報告基因表達(dá)的改變，來確定轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動子結(jié)合位點(diǎn)及對靶基因的作用。

miRNA研究：主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用（降解或抑制翻譯），將目的基因3’UTR（野生型和結(jié)合位點(diǎn)突變型）序列構(gòu)建至載體報告基因螢火蟲熒光素酶的3’端，通過比較過表達(dá)miRNA后，報告基因表達(dá)的改變（螢光素酶的活性下降還是不變），來確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點(diǎn)。 熒光素酶檢測試劑盒(螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶由于都是非分泌型蛋白，所以在檢測之前需要對過表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行裂解處理)：

貨號	產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品特性	熒光素酶	規(guī)格
LF001	Luc-Pair™ Duo-Luciferase Assay Kit 2.0 Hot !	穩(wěn)定型	螢火蟲（Fluc） 海腎（Rluc）	100rxns
LF002				300rxns
LF003				1000rxns
LF004	Luc-Pair™ Duo-Luciferase HS Assay Kit Hot !	高靈敏型	螢火蟲（Fluc） 海腎（Rluc）	100rxns
LF005				300rxns
LF006				1000rxns
LF007	Luc-Pair™ Firefly Luciferase HS Assay Kits	高靈敏型	螢火蟲（Fluc)	100rxns
LF008				300rxns
LF009				1000rxns
LF010	Luc-Pair™ Renilla Luciferase HS Assay Kit	高靈敏型	海腎（Rluc）	100rxns
LF011				300rxns
LF012				1000rxns
LF013	Luc-Pair™ Duo-Luciferase HT Assay Kit	穩(wěn)定型， 無需預(yù)先裂解細(xì)胞，適用高通量分析	螢火蟲（Fluc） 海腎（Rluc）	10mL
LF014				30mL
LF015				100mL
LF016	Luc-Pair ™ Firefly  Luciferase HT Assay Kit	穩(wěn)定型， 無需預(yù)先裂解細(xì)胞，適用高通量分析	螢火蟲（Fluc）	10mL
LF017				30mL
LF018				100mL
LF019	Luc-Pair™ Renilla Luciferase HT Assay Kit	穩(wěn)定型， 無需預(yù)先裂解細(xì)胞，適用高通量分析	海腎（Rluc）	10mL
LF020				30mL
LF021				100mL

貨號	產(chǎn)品	啟動子	報告基因	示蹤基因	篩選標(biāo)記	抗性	研究
ZX001	pEZX-FR01(10µg)	N/A*	Firefly (hLuc)	Renilla (Rluc)	Puromycin	Kanamycin	常規(guī)啟動子等研究
ZX002	pEZX-FR02(10µg)	SV40	Firefly (hLuc)	Renilla (Rluc)	N/A*	Ampicillin	UTR靶標(biāo)等研究
ZX003	pEZX-FR03(10µg)	miniCMV	Firefly( hLuc)	Renilla (RLuc)	Puromycin	Kanamycin	轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等研究

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