模擬微重力培養(yǎng)的人顱骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠腦梗死的修復(fù)作用研究

前言
腦卒中（腦梗死）作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙性疾病，臨床治療難度大，一直是神經(jīng)科領(lǐng)域的診療難題。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）因可自體移植、自我更新、低免疫排斥且倫理爭議小，成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞治療的研究熱點(diǎn)，而其來源組織和培養(yǎng)環(huán)境，直接影響移植的治療效果。

人顱骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hcMSCs）作為神經(jīng)嵴來源的新型MSCs，已被證實(shí)具有比骨髓來源MSCs更強(qiáng)的神經(jīng)發(fā)生能力，在腦梗模型中能通過高表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。同時(shí)，模擬微重力（sMG）環(huán)境下培養(yǎng)的MSCs，在腦和脊髓損傷模型中展現(xiàn)出更強(qiáng)的遷移能力和神經(jīng)保護(hù)效果，但sMG培養(yǎng)的hcMSCs對(duì)腦梗死的作用及機(jī)制尚未明確。

本研究依托日本廣島大學(xué)的科研團(tuán)隊(duì)，借助Gravite®模擬微重力培養(yǎng)裝置，深入探究了sMG環(huán)境培養(yǎng)的hcMSCs對(duì)大鼠腦梗死模型的治療效果及潛在機(jī)制，為腦梗的干細(xì)胞治療提供了全新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

摘要
本研究旨在探究模擬微重力（sMG）環(huán)境培養(yǎng)的人顱骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hcMSCs）對(duì)大鼠腦梗死模型的治療效果。

研究將hcMSCs分為正常重力（1G）組和sMG組培養(yǎng)，于大鼠腦梗死造模1天后通過尾靜脈移植，術(shù)后35天從神經(jīng)功能、組織分子表達(dá)、細(xì)胞基因測序等多維度分析。結(jié)果顯示，sMG組hcMSCs移植后，大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)顯著優(yōu)于1G組；梗死腦組織中神經(jīng)生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子2、突觸素的mRNA表達(dá)顯著升高，sortilin 1表達(dá)顯著降低；RNA測序發(fā)現(xiàn)，sMG組hcMSCs中與細(xì)胞增殖、血管生成、神經(jīng)營養(yǎng)、神經(jīng)突觸形成及細(xì)胞分化抑制相關(guān)的基因顯著上調(diào)，而促進(jìn)微管、細(xì)胞外基質(zhì)形成及細(xì)胞黏附、信號(hào)傳導(dǎo)、分化的基因顯著下調(diào)。免疫組織化學(xué)檢測證實(shí)，sMG組梗死邊緣區(qū)的神經(jīng)元標(biāo)志物陽性細(xì)胞率顯著更高，蛋白水平檢測也顯示突觸素表達(dá)顯著上調(diào)。

研究首次證實(shí)，sMG環(huán)境培養(yǎng)的hcMSCs可通過調(diào)控相關(guān)基因和蛋白表達(dá)，促進(jìn)腦梗后神經(jīng)功能恢復(fù)，或成為腦梗后神經(jīng)功能修復(fù)的有效干細(xì)胞來源。

結(jié)果
1. Gravite®培養(yǎng)的hcMSCs形態(tài)與表面標(biāo)志物無顯著變化。
本研究使用Gravite®構(gòu)建模擬微重力環(huán)境培養(yǎng)hcMSCs5天。形態(tài)學(xué)觀察顯示，1G組和sMG組（Gravite®培養(yǎng)）的hcMSCs均呈梭形和卵圓形，無明顯形態(tài)差異；流式細(xì)胞術(shù)檢測證實(shí)，兩組hcMSCs均高表達(dá)MSCs陽性標(biāo)志物（CD73、CD90、CD105），低表達(dá)陰性標(biāo)志物（CD34、CD45)。

 

2. Gravite®培養(yǎng)的hcMSCs基因表達(dá)譜發(fā)生特異性改變。
對(duì)1G和sMG組hcMSCs進(jìn)行RNA測序發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞增殖、遷移、血管生成、神經(jīng)營養(yǎng)、神經(jīng)突觸形成、抗炎抗凋亡及細(xì)胞分化抑制相關(guān)（如FGF-7、VEGF-A、GDNF）基因表達(dá)上調(diào)，與微管和細(xì)胞骨架形成穩(wěn)定、細(xì)胞黏附、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞分化及凋亡誘導(dǎo)相關(guān)（如CTSS、LAMA1、ITGB3）基因表達(dá)下調(diào)。GO富集分析進(jìn)一步驗(yàn)證，sMG組hcMSCs在血管生成、神經(jīng)營養(yǎng)、神經(jīng)突觸組織等通路顯著激活，而細(xì)胞外基質(zhì)、微管形成等通路顯著抑制，為其腦梗治療的有效性奠定分子基礎(chǔ)。

3. Gravite®培養(yǎng)的hcMSCs顯著改善腦梗大鼠神經(jīng)功能。
將大鼠分為PBS對(duì)照組、1G組、sMG組（Gravite®培養(yǎng)hcMSCs），采用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（mNSS）評(píng)估術(shù)后35天神經(jīng)功能發(fā)現(xiàn)，sMG組大鼠從造模后3天開始，神經(jīng)功能恢復(fù)即顯著優(yōu)于PBS組，7天后顯著優(yōu)于1G組；術(shù)后14、21、28、35天，sMG組mNSS評(píng)分顯著低于1G組，證實(shí)sMG環(huán)境培養(yǎng)的hcMSCs對(duì)腦梗大鼠神經(jīng)功能的修復(fù)效果顯著優(yōu)于正常重力培養(yǎng)的細(xì)胞。
 

4. Gravite®培養(yǎng)的hcMSCs促進(jìn)腦梗灶周圍神經(jīng)元與突觸再生。
術(shù)后35天對(duì)大鼠梗死邊緣區(qū)（IBZ）進(jìn)行熒光染色可見，sMG組梗死邊緣區(qū)SYP和Tuj1的染色強(qiáng)度更強(qiáng)，分布更密集，說明sMG培養(yǎng)的hcMSCs能有效促進(jìn)腦梗后梗死周圍的神經(jīng)元再生和突觸形成。

5. Gravite®培養(yǎng)的hcMSCs調(diào)控腦梗灶內(nèi)關(guān)鍵基因與蛋白表達(dá)。
sMG組梗死腦組織中Ngf（神經(jīng)生長因子）、Fgf2（成纖維細(xì)胞生長因子2）、Syp（突觸素）的mRNA表達(dá)顯著高于PBS組，Syp表達(dá)同時(shí)顯著高于1G組，而促神經(jīng)元凋亡的Sort1表達(dá)顯著低于PBS組。sMG組梗死腦組織中SYP蛋白表達(dá)顯著高于PBS組，與1G組無顯著差異；BAX（促凋亡蛋白）、BCL-XL（抗凋亡蛋白）在三組間無顯著差異，提示其抗凋亡作用可能需更長時(shí)間觀察或存在其他調(diào)控通路。

結(jié)論
Gravite®模擬微重力培養(yǎng)裝置構(gòu)建的sMG環(huán)境，雖未改變hcMSCs的基本表型，卻通過調(diào)控其基因表達(dá)譜，使其能有效促進(jìn)腦梗大鼠的血管生成、神經(jīng)營養(yǎng)、神經(jīng)元再生和突觸形成，最終顯著改善神經(jīng)功能恢復(fù)。

這一研究首次證實(shí)，模擬微重力環(huán)境培養(yǎng)的人顱骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，有望成為腦梗死細(xì)胞治療的新型有效干細(xì)胞來源，為臨床腦梗的干細(xì)胞治療研發(fā)提供了重要的實(shí)驗(yàn)支撐。

文章鏈接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39265921/

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日本Gravite擬太空微環(huán)境活細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

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On-chip Droplet Generator 微液滴高速生成系統(tǒng)

• 采用獨(dú)立的微流控芯片輕松實(shí)現(xiàn)大量穩(wěn)定且均一的液滴制備；
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On-chip Droplet selector 超快速微流控單細(xì)胞精準(zhǔn)分選系統(tǒng)

• 逐個(gè)分離目標(biāo)液滴，將分離的液滴直接 分注到細(xì)胞培養(yǎng)板的孔內(nèi)，完成96孔板分離僅需10分鐘，也可對(duì)細(xì)胞或者GMD等進(jìn)行檢測；
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On-chip sort 微流控細(xì)胞高速分選系統(tǒng) 

• 微流控芯片集成了樣本的檢測、分 離、回收，實(shí)現(xiàn)小型化和簡單化操作；
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日本AS ONE全自動(dòng)高通量單細(xì)胞可視化篩選系統(tǒng)

 

• 基于微孔芯片技術(shù)，單次處理20萬-30萬細(xì)胞，高通量高效
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• 可以從數(shù)萬~數(shù)十萬細(xì)胞中回收一個(gè)細(xì)胞，使原來的流式細(xì)胞儀達(dá)不到的技術(shù)成為可能。 在抗體開發(fā)、癌癥研究、再生醫(yī)療等場景中，以高通量、無損化、精準(zhǔn)化突破傳統(tǒng)技術(shù)瓶頸， 成為單細(xì)胞功能分析與臨床轉(zhuǎn)化的核心工具。

日本fullstem靜態(tài)3D高效干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) 

• 使用無紡布做作為培養(yǎng)載體，能夠培養(yǎng)可用于臨床治療的高質(zhì)量細(xì)胞。 
• 目標(biāo)細(xì)胞：貼壁細(xì)胞（間質(zhì)干細(xì)胞、ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞等）
• 培養(yǎng)方法：通過無紡布支架實(shí)現(xiàn)高密度、節(jié)省空間的培養(yǎng)面積 
• 培養(yǎng)量：通過調(diào)整無紡布的數(shù)量，可以培養(yǎng)1000萬至20億個(gè)細(xì)胞（大約是人工的20倍） 
• 細(xì)胞質(zhì)量：無紡布腳手架幾乎沒有流體應(yīng)力，不會(huì)發(fā)生干細(xì)胞性質(zhì)變化或腫瘤化 外泌體產(chǎn)量，專利技術(shù)可實(shí)現(xiàn)比正常外泌體生產(chǎn)高四倍的外泌體生產(chǎn)。

日本LINACYTE無損等離子體基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)

• 等離子體基因?qū)�入利用放電產(chǎn)生的等離子向細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)導(dǎo)入基因片段或分子的技術(shù)。不需要特殊的試劑或病毒，快速有效地進(jìn)行基因?qū)�入�?/p>

• 等離子體可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生胞吞作用,這使得基因?qū)�入接近更自然的方式，減少對(duì)細(xì)胞的刺激。