文獻解讀：利用WGBS驗證開發(fā)新型DNA甲基化編輯多功能分子工具箱
大家好，這里是專注表觀組學十余年，領跑多組學科研服務的易基因。
近日，中國科學院分子植物科學卓越創(chuàng)新中心何力副研究員和姚瑤博士為共同第一作者，南方科技大學朱健康院士（現澳門科技大學校長）和郎曌博教授為共同通訊作者，在《Nature Communications》期刊發(fā)表題為“Versatile molecular tools enabling customizable DNA methylation editing in Arabidopsis”的科研成果，開發(fā)了一套基于CRISPR/dCas9系統的定制化植物DNA甲基化精準編輯工具箱。
該研究通過將催化失活的Cas9（dCas9）與多種DNA甲基化/去甲基化效應蛋白（effectors）及表觀遺傳輔助因子（cofactors）融合，系統構建了5種靶向甲基化工具和6種靶向去甲基化工具。此外，研究團隊以擬南芥為模式生物，利用全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）、染色質可及性測序（ATAC-seq）等技術，系統評估了這些工具在FWA基因啟動子、FT基因遠端增強子及SDC基因啟動子等位點的編輯效率、特異性及遺傳穩(wěn)定性等方面�？傊�，該工具箱實現了從位點特異性編輯到全基因組水平調控的多樣化應用，且編輯后的甲基化修飾可在無轉基因狀態(tài)下穩(wěn)定遺傳，為植物表觀遺傳育種和功能研究提供了關鍵技術支撐。
英文標題：Versatile molecular tools enabling customizable DNA methylation editing in Arabidopsis
中文標題：多功能分子工具實現擬南芥DNA甲基化的精準定制編輯
發(fā)表時間：2025年12月6日
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：IF15.7/Q1
技術平臺：WGBS、ATAC-seq
作者單位：中國科學院分子植物科學卓越創(chuàng)新中心、南方科技大學
DOI:10.1038/s41467-025-66933-z
易小結
本研究在植物表觀遺傳工程領域實現了重大突破，系統性構建并驗證一套多功能、可遺傳的DNA甲基化編輯工具，將表觀基因組編輯從“概念驗證”推向“工具箱化”應用階段。
本研究充分展示了WGBS作為DNA甲基化檢測金標準在表觀編輯效果評估中的核心地位。WGBS不僅能夠以單堿基分辨率精確量化目標區(qū)域的甲基化水平，更能全面捕捉全基因組范圍內的甲基化變化趨勢，為編輯工具的特異性評價提供了不可替代的數據支撐。
研究方法
（1）融合蛋白構建
（1）基于Cas9的單融合蛋白用于DNA甲基化編輯
本研究設計了CRISPR-based融合蛋白系統，將效應蛋白（甲基轉移酶或去甲基化酶）置于dCas9的N端，以優(yōu)化其接觸胞嘧啶進行編輯；將輔助因子（參與表觀調控的蛋白）置于dCas9的C端，以增強效應蛋白的活性（圖1a）。具體而言，甲基化效應蛋白包括哺乳動物的DNMT3A-3L、擬南芥的DRM2、煙草的NtDRMcd和細菌變體MQ1v；去甲基化效應蛋白包括擬南芥的ROS1及其催化域（ROS1cd）和人類的TET1催化域（TET1cd）。輔助因子則包括轉錄抑制子（人源KRAB、擬南芥SRDX）、組蛋白H3K9甲基轉移酶KYP、組蛋白乙酰轉移酶p300及H3K9me2去甲基化酶IBM1/IBM1cd。通過效應蛋白、輔助因子和啟動子的組合，構建了38種甲基化編輯工具（M1-M38）和30種去甲基化編輯工具（D1-D30）。
（2）在FWA啟動子區(qū)域的靶向DNA甲基化
研究以FWA啟動子為首個測試靶點，該位點在野生型中通過DNA甲基化維持沉默，去甲基化導致晚花表型。研究團隊測試了38種甲基化工具。通過觀察T1代植株是否恢復早花表型（圖1c、e）來初篩編輯工具。結果顯示，由pRPS5A啟動子驅動的工具（M6、M12、M14、M16、M22、M30）可誘導早花表型，而UBQ1啟動子驅動工具無效，表明RPS5A啟動子具有更優(yōu)的編輯效能。其中，MQ1v-dCas9 (M14) 和 MQ1v-dCas9-KRAB (M22) 誘導早花效率最高。RT-qPCR證實早花植株中FWA表達被抑制（圖1d）。
關鍵的WGBS分析（圖1f）直接證實，早花植株的FWA啟動子區(qū)域被de novo甲基化，且不同工具誘導的甲基化類型（CG或非CG）不同。如M14特異性誘導CG甲基化，而M22和M30可誘導CG和非CG甲基化，且M30的非CG甲基化水平高于M22，表明SRDX輔助因子可拓展MQ1v的非CG甲基化功能。
（3）FWA啟動子甲基化工具的特異性表征
通過WGBS全基因組甲基化分析評估工具特異性，M6和M12編輯植株在FWA啟動子及周圍區(qū)域及全基因組范圍的甲基化水平與fwa對照無顯著差異（圖1f），表明其具有高度特異性。而M14在CG位點出現顯著甲基化，M22程度較輕，M30最低（圖1f）。全基因組CG甲基化水平分析（圖1g）顯示M14和M22顯著高于fwa，而M30與fwa類似。值得注意的是，M14、M22、M30含同一效應蛋白MQ1v，僅輔助因子不同，表明SRDX可顯著提高特異性。此外，工具的特異性與其在靶點的編輯效率大致呈負相關。
（4）靶向FWA啟動子DNA甲基化的可遺傳性
為評估編輯的穩(wěn)定性，研究人員分析了編輯工具的T1代植株后代（T2代）。分析結果顯示，在轉基因分離后（T2代不含轉基因的植株），早花表型、FWA表達抑制以及FWA啟動子的高甲基化狀態(tài)依然穩(wěn)定存在（圖2a-c），表明這些工具誘導的甲基化修飾是可遺傳的表觀記憶，不依賴于轉基因的持續(xù)存在。
（5）FT基因遠端增強子的靶向DNA甲基化
為驗證工具普適性，研究靶向FT基因增強子Block C，該位點甲基化導致野生型晚花（圖3a）。所有FWA有效工具（M6, M12, M14, M22, M30）均能在FT增強子誘導晚花表型（圖3b-c），但各工具效率排名有所變化，M6在FT位點效率最高，提示靶位點染色質環(huán)境影響工具效能。WGBS分析再次確認了工具的特異性差異（圖3d）：M12特異性甲基化靶位點且不改變全基因組甲基化；M14在靶位點及周圍CG位點廣泛甲基化，M22和M30程度較輕；僅M14顯著提高全基因組CG甲基化，但效應弱于FWA背景。有趣的是，M6在此并未檢測到明顯的DNA甲基化，推測其表型可能是通過輔助因子KYP誘導的H3K9me2間接導致。此外，編輯的遺傳性也在T2代中得到驗證（圖3d-e）。
（6）FWA啟動子區(qū)域的靶向DNA去甲基化
研究同時構建了30種去甲基化工具。在野生型（其FWA啟動子甲基化導致基因沉默）中靶向該區(qū)域，成功去甲基化將激活FWA表達并導致晚花表型（圖4a）。篩選發(fā)現，由pRPS5A驅動的工具效果更好，其中ROS1-dCas9 (D10)、TET1cd-dCas9 (D12)、TET1cd-dCas9-p300 (D18)、TET1cd-dCas9-IBM1cd (D24) 和 TET1cd-dCas9-IBM1 (D30) 能誘導不同程度的晚花（圖4b、d）。RT-qPCR顯示FWA激活與甲基化降低負相關（圖4c），WGBS分析直接證實這些植株的FWA啟動子發(fā)生了去甲基化，且TET1cd-based工具（D12、D24, D30）的去甲基化效能優(yōu)于ROS1工具（D10）（圖4e）。
（7）FWA啟動子去甲基化工具的特異性表征
研究團隊通過WGBS全基因組甲基化分析揭示了去甲基化工具的特異性譜系（圖4f）。ROS1-dCas9(D10)和TET1cd-dCas9-p300(D18)特異性最高，全基因組甲基化水平與野生型相似。TET1cd-dCas9 (D12)和TET1cd-dCas9-IBM1cd(D24)有輕微的全局去甲基化效應。而TET1cd-dCas9-IBM1(D30)顯著降低全基因組CG甲基化，特異性最低但效率最高。表明輔助因子p300有助于提高特異性，而IBM1則增強效率的輔助因子效應。
（8）FWA啟動子的靶向DNA去甲基化可遺傳性
與甲基化工具類似，去甲基化工具誘導的修飾也能穩(wěn)定遺傳。在T2代植株（無論是否含轉基因）中，仍能觀察到晚花表型（圖5a）、FWA表達激活（圖5b）以及FWA啟動子的低甲基化狀態(tài)（圖5c）。例如，D10工具在T1代僅部分去甲基化，但在部分T2代中實現了完全去甲基化，表明ROS1可能需要多代傳遞才能達到完全效果。WGBS跨代數據確立了去甲基化修飾的穩(wěn)定遺傳功能。
（9）SDC啟動子區(qū)域的靶向去甲基化
研究團隊分析了另一個受RdDM通路調控甲基化的靶標SDC啟動子，該位點甲基化沉默SDC，去甲基化激活導致葉片卷曲（圖6a）。分析結果發(fā)現，野生型中所有去甲基化工具在T1代均未能誘導出預期的卷葉表型（圖6d），ChIP-seq數據顯示SDC啟動子富集于RdDM通路核心組分Pol IV，推測RdDM通路拮抗去甲基化。于是研究團隊將工具轉入RdDM缺失介導的nrpe1突變體中，成功在T1代觀察到卷葉表型（圖6b、d），其中TET1cd-dCas9-IBM1 (D30) 和 TET1cd-dCas9 (D12) 效率最高。RT-qPCR和WGBS（圖6c、e）證實卷曲葉植株SDC表達激活且啟動子去甲基化。此外在野生型背景下，部分高效工具在T2代也誘導出卷葉表型。WGBS證實其SDC啟動子去甲基化和基因激活，表明IBM1輔助因子可提升ROS1工具效能。
SDC位點及全基因組甲基化（圖6e-f）WGBS分析進一步驗證了工具的特異性特征：TET1cd-dCas9-p300 (D18) 特異性高；TET1cd-dCas9 (D12) 和 TET1cd-dCas9-IBM1cd (D24) 特異性較低；TET1cd-dCas9-IBM1 (D30) 在部分植株中能導致強烈的全基因組去甲基化；而ROS1-dCas9-IBM1 (D28) 則表現出誘導全基因組CHG去甲基化的傾向。WGBS全面描繪了不同工具在RdDM缺失和野生型背景下的特異性差異。
（11）SDC啟動子的靶向DNA甲基化可遺傳
最后，研究團隊分析了nrpe1背景T1編輯植株的后代。分析結果顯示，在nrpe1背景下，去甲基化工具誘導的卷葉表型、SDC表達激活以及啟動子低甲基化狀態(tài)，在T2代（無論是否含轉基因）中均能穩(wěn)定遺傳（圖7a-c）。即使在野生型背景下，T30誘導的全基因組CG低甲基化和D28誘導的全基因組CHG低甲基化，在無轉基因的T2代中也得以保留，再次證明這些表觀編輯的遺傳穩(wěn)定性。
結論和啟示
本研究成功開發(fā)了一套多功能、可定制化的植物DNA甲基化編輯工具箱，包含5種甲基化工具（M6、M12、M14、M22、M30）和6種去甲基化工具（D10、D12、D18、D24、D28、D30），實現了從位點特異性到全基因組水平、從瞬時表達到跨代遺傳的多樣化應用。
核心亮點包括：
參考文獻：He L, Yao Y, You Y, Wei X, Ma Y, Yuan W, Lang Z, Zhu JK. Versatile molecular tools enabling customizable DNA methylation editing in Arabidopsis. Nat Commun. 2025 Dec 6. doi: 10.1038/s41467-025-66933-z.
近日，中國科學院分子植物科學卓越創(chuàng)新中心何力副研究員和姚瑤博士為共同第一作者，南方科技大學朱健康院士（現澳門科技大學校長）和郎曌博教授為共同通訊作者，在《Nature Communications》期刊發(fā)表題為“Versatile molecular tools enabling customizable DNA methylation editing in Arabidopsis”的科研成果，開發(fā)了一套基于CRISPR/dCas9系統的定制化植物DNA甲基化精準編輯工具箱。
該研究通過將催化失活的Cas9（dCas9）與多種DNA甲基化/去甲基化效應蛋白（effectors）及表觀遺傳輔助因子（cofactors）融合，系統構建了5種靶向甲基化工具和6種靶向去甲基化工具。此外，研究團隊以擬南芥為模式生物，利用全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）、染色質可及性測序（ATAC-seq）等技術，系統評估了這些工具在FWA基因啟動子、FT基因遠端增強子及SDC基因啟動子等位點的編輯效率、特異性及遺傳穩(wěn)定性等方面�？傊�，該工具箱實現了從位點特異性編輯到全基因組水平調控的多樣化應用，且編輯后的甲基化修飾可在無轉基因狀態(tài)下穩(wěn)定遺傳，為植物表觀遺傳育種和功能研究提供了關鍵技術支撐。
英文標題：Versatile molecular tools enabling customizable DNA methylation editing in Arabidopsis
中文標題：多功能分子工具實現擬南芥DNA甲基化的精準定制編輯
發(fā)表時間：2025年12月6日
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：IF15.7/Q1
技術平臺：WGBS、ATAC-seq
作者單位：中國科學院分子植物科學卓越創(chuàng)新中心、南方科技大學
DOI:10.1038/s41467-025-66933-z
易小結
本研究在植物表觀遺傳工程領域實現了重大突破，系統性構建并驗證一套多功能、可遺傳的DNA甲基化編輯工具，將表觀基因組編輯從“概念驗證”推向“工具箱化”應用階段。
本研究充分展示了WGBS作為DNA甲基化檢測金標準在表觀編輯效果評估中的核心地位。WGBS不僅能夠以單堿基分辨率精確量化目標區(qū)域的甲基化水平，更能全面捕捉全基因組范圍內的甲基化變化趨勢，為編輯工具的特異性評價提供了不可替代的數據支撐。
研究方法
（1）融合蛋白構建
- 采用模塊化策略，將不同來源的效應蛋白（甲基化酶DNMT3A-3L、DRM2、NtDRMcd、MQ1v；去甲基化酶ROS1、ROS1cd、TET1cd）與輔助因子（增強甲基化的KRAB、SRDX、KYP；增強去甲基化的p300、IBM1、IBM1cd）通過柔性連接肽（XTEN）分別融合到dCas9的N端和C端。使用pUBQ1或pRPS5A啟動子驅動表達，構建于pCAMBIA1300載體中。
- 所有實驗使用哥倫比亞生態(tài)型（Col-0）擬南芥。采用農桿菌介導的花序浸染法轉化pCAMBIA1300二元載體，通過50mg/L潮霉素篩選轉基因植株，將構建好的工具載體分別轉入不同的遺傳背景（如fwa表觀等位基因系、野生型、nrpe1突變體等）中。
- 以開花時間（通過蓮座葉數量量化）和葉片卷曲作為DNA甲基化狀態(tài)改變的直觀報告表型，分別對應FWA、FT和SDC位點的編輯效果。
- RT-qPCR：檢測靶基因（FWA, SDC）的表達水平變化。
- Western Blot：檢測dCas9融合蛋白的表達水平，分析工具效率與蛋白豐度的關系。
- 全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）
- 靶位點驗證：精確評估FWA啟動子、FT增強子Block C、SDC啟動子等靶區(qū)域甲基化水平變化。
- 特異性評估：分析靶位點周圍區(qū)域及全基因組范圍的甲基化水平，量化工具的脫靶效應。
- 遺傳性分析：在T1、T2代（無論是否含有轉基因）中追蹤甲基化變化的遺傳穩(wěn)定性。
- 差異甲基化區(qū)域（DMR）鑒定：系統鑒定全基因組范圍內顯著高甲基化或低甲基化區(qū)域，并分析其基因組分布特征（如著絲粒周邊區(qū)域富集情況）以及與已知甲基化通路的關聯。
- ATAC-seq：
- 5周齡野生型蓮座葉提取細胞核進行ATAC-seq測序分析，以確定FT基因遠端增強子Block C的開放染色質區(qū)域位置，為靶點設計提供依據。
- 通過T1代自交獲得T2代亞群，使用兩對引物（分別靶向gRNA和載體骨架）進行基因型鑒定，區(qū)分含轉基因（+）和無轉基因（-）植株，評估甲基化編輯的跨代遺傳功能。
（1）基于Cas9的單融合蛋白用于DNA甲基化編輯
本研究設計了CRISPR-based融合蛋白系統，將效應蛋白（甲基轉移酶或去甲基化酶）置于dCas9的N端，以優(yōu)化其接觸胞嘧啶進行編輯；將輔助因子（參與表觀調控的蛋白）置于dCas9的C端，以增強效應蛋白的活性（圖1a）。具體而言，甲基化效應蛋白包括哺乳動物的DNMT3A-3L、擬南芥的DRM2、煙草的NtDRMcd和細菌變體MQ1v；去甲基化效應蛋白包括擬南芥的ROS1及其催化域（ROS1cd）和人類的TET1催化域（TET1cd）。輔助因子則包括轉錄抑制子（人源KRAB、擬南芥SRDX）、組蛋白H3K9甲基轉移酶KYP、組蛋白乙酰轉移酶p300及H3K9me2去甲基化酶IBM1/IBM1cd。通過效應蛋白、輔助因子和啟動子的組合，構建了38種甲基化編輯工具（M1-M38）和30種去甲基化編輯工具（D1-D30）。
圖1：一系列靶向FWA啟動子DNA甲基化的工具
（2）在FWA啟動子區(qū)域的靶向DNA甲基化
研究以FWA啟動子為首個測試靶點，該位點在野生型中通過DNA甲基化維持沉默，去甲基化導致晚花表型。研究團隊測試了38種甲基化工具。通過觀察T1代植株是否恢復早花表型（圖1c、e）來初篩編輯工具。結果顯示，由pRPS5A啟動子驅動的工具（M6、M12、M14、M16、M22、M30）可誘導早花表型，而UBQ1啟動子驅動工具無效，表明RPS5A啟動子具有更優(yōu)的編輯效能。其中，MQ1v-dCas9 (M14) 和 MQ1v-dCas9-KRAB (M22) 誘導早花效率最高。RT-qPCR證實早花植株中FWA表達被抑制（圖1d）。
關鍵的WGBS分析（圖1f）直接證實，早花植株的FWA啟動子區(qū)域被de novo甲基化，且不同工具誘導的甲基化類型（CG或非CG）不同。如M14特異性誘導CG甲基化，而M22和M30可誘導CG和非CG甲基化，且M30的非CG甲基化水平高于M22，表明SRDX輔助因子可拓展MQ1v的非CG甲基化功能。
（3）FWA啟動子甲基化工具的特異性表征
通過WGBS全基因組甲基化分析評估工具特異性，M6和M12編輯植株在FWA啟動子及周圍區(qū)域及全基因組范圍的甲基化水平與fwa對照無顯著差異（圖1f），表明其具有高度特異性。而M14在CG位點出現顯著甲基化，M22程度較輕，M30最低（圖1f）。全基因組CG甲基化水平分析（圖1g）顯示M14和M22顯著高于fwa，而M30與fwa類似。值得注意的是，M14、M22、M30含同一效應蛋白MQ1v，僅輔助因子不同，表明SRDX可顯著提高特異性。此外，工具的特異性與其在靶點的編輯效率大致呈負相關。
（4）靶向FWA啟動子DNA甲基化的可遺傳性
為評估編輯的穩(wěn)定性，研究人員分析了編輯工具的T1代植株后代（T2代）。分析結果顯示，在轉基因分離后（T2代不含轉基因的植株），早花表型、FWA表達抑制以及FWA啟動子的高甲基化狀態(tài)依然穩(wěn)定存在（圖2a-c），表明這些工具誘導的甲基化修飾是可遺傳的表觀記憶，不依賴于轉基因的持續(xù)存在。
圖2：FWA啟動子的靶向DNA甲基化具有可遺傳性
（5）FT基因遠端增強子的靶向DNA甲基化
為驗證工具普適性，研究靶向FT基因增強子Block C，該位點甲基化導致野生型晚花（圖3a）。所有FWA有效工具（M6, M12, M14, M22, M30）均能在FT增強子誘導晚花表型（圖3b-c），但各工具效率排名有所變化，M6在FT位點效率最高，提示靶位點染色質環(huán)境影響工具效能。WGBS分析再次確認了工具的特異性差異（圖3d）：M12特異性甲基化靶位點且不改變全基因組甲基化；M14在靶位點及周圍CG位點廣泛甲基化，M22和M30程度較輕；僅M14顯著提高全基因組CG甲基化，但效應弱于FWA背景。有趣的是，M6在此并未檢測到明顯的DNA甲基化，推測其表型可能是通過輔助因子KYP誘導的H3K9me2間接導致。此外，編輯的遺傳性也在T2代中得到驗證（圖3d-e）。
圖3：FT增強子Block C的靶向DNA甲基化
（6）FWA啟動子區(qū)域的靶向DNA去甲基化
研究同時構建了30種去甲基化工具。在野生型（其FWA啟動子甲基化導致基因沉默）中靶向該區(qū)域，成功去甲基化將激活FWA表達并導致晚花表型（圖4a）。篩選發(fā)現，由pRPS5A驅動的工具效果更好，其中ROS1-dCas9 (D10)、TET1cd-dCas9 (D12)、TET1cd-dCas9-p300 (D18)、TET1cd-dCas9-IBM1cd (D24) 和 TET1cd-dCas9-IBM1 (D30) 能誘導不同程度的晚花（圖4b、d）。RT-qPCR顯示FWA激活與甲基化降低負相關（圖4c），WGBS分析直接證實這些植株的FWA啟動子發(fā)生了去甲基化，且TET1cd-based工具（D12、D24, D30）的去甲基化效能優(yōu)于ROS1工具（D10）（圖4e）。
圖4：FWA啟動子區(qū)域的靶向去甲基化
（7）FWA啟動子去甲基化工具的特異性表征
研究團隊通過WGBS全基因組甲基化分析揭示了去甲基化工具的特異性譜系（圖4f）。ROS1-dCas9(D10)和TET1cd-dCas9-p300(D18)特異性最高，全基因組甲基化水平與野生型相似。TET1cd-dCas9 (D12)和TET1cd-dCas9-IBM1cd(D24)有輕微的全局去甲基化效應。而TET1cd-dCas9-IBM1(D30)顯著降低全基因組CG甲基化，特異性最低但效率最高。表明輔助因子p300有助于提高特異性，而IBM1則增強效率的輔助因子效應。
（8）FWA啟動子的靶向DNA去甲基化可遺傳性
與甲基化工具類似，去甲基化工具誘導的修飾也能穩(wěn)定遺傳。在T2代植株（無論是否含轉基因）中，仍能觀察到晚花表型（圖5a）、FWA表達激活（圖5b）以及FWA啟動子的低甲基化狀態(tài)（圖5c）。例如，D10工具在T1代僅部分去甲基化，但在部分T2代中實現了完全去甲基化，表明ROS1可能需要多代傳遞才能達到完全效果。WGBS跨代數據確立了去甲基化修飾的穩(wěn)定遺傳功能。
圖5：FWA啟動子的靶向去甲基化具有遺傳性
（9）SDC啟動子區(qū)域的靶向去甲基化
研究團隊分析了另一個受RdDM通路調控甲基化的靶標SDC啟動子，該位點甲基化沉默SDC，去甲基化激活導致葉片卷曲（圖6a）。分析結果發(fā)現，野生型中所有去甲基化工具在T1代均未能誘導出預期的卷葉表型（圖6d），ChIP-seq數據顯示SDC啟動子富集于RdDM通路核心組分Pol IV，推測RdDM通路拮抗去甲基化。于是研究團隊將工具轉入RdDM缺失介導的nrpe1突變體中，成功在T1代觀察到卷葉表型（圖6b、d），其中TET1cd-dCas9-IBM1 (D30) 和 TET1cd-dCas9 (D12) 效率最高。RT-qPCR和WGBS（圖6c、e）證實卷曲葉植株SDC表達激活且啟動子去甲基化。此外在野生型背景下，部分高效工具在T2代也誘導出卷葉表型。WGBS證實其SDC啟動子去甲基化和基因激活，表明IBM1輔助因子可提升ROS1工具效能。
圖6：SDC啟動子的靶向去甲基化
（10）SDC啟動子去甲基化工具的特異性表征SDC位點及全基因組甲基化（圖6e-f）WGBS分析進一步驗證了工具的特異性特征：TET1cd-dCas9-p300 (D18) 特異性高；TET1cd-dCas9 (D12) 和 TET1cd-dCas9-IBM1cd (D24) 特異性較低；TET1cd-dCas9-IBM1 (D30) 在部分植株中能導致強烈的全基因組去甲基化；而ROS1-dCas9-IBM1 (D28) 則表現出誘導全基因組CHG去甲基化的傾向。WGBS全面描繪了不同工具在RdDM缺失和野生型背景下的特異性差異。
（11）SDC啟動子的靶向DNA甲基化可遺傳
最后，研究團隊分析了nrpe1背景T1編輯植株的后代。分析結果顯示，在nrpe1背景下，去甲基化工具誘導的卷葉表型、SDC表達激活以及啟動子低甲基化狀態(tài)，在T2代（無論是否含轉基因）中均能穩(wěn)定遺傳（圖7a-c）。即使在野生型背景下，T30誘導的全基因組CG低甲基化和D28誘導的全基因組CHG低甲基化，在無轉基因的T2代中也得以保留，再次證明這些表觀編輯的遺傳穩(wěn)定性。
圖7：SDC啟動子的靶向去甲基化具有遺傳性
結論和啟示
本研究成功開發(fā)了一套多功能、可定制化的植物DNA甲基化編輯工具箱，包含5種甲基化工具（M6、M12、M14、M22、M30）和6種去甲基化工具（D10、D12、D18、D24、D28、D30），實現了從位點特異性到全基因組水平、從瞬時表達到跨代遺傳的多樣化應用。
核心亮點包括：
- 輔助因子工程是優(yōu)化編輯工具的關鍵策略；
- WGBS等全基因組測序技術是評估表觀編輯特異性和遺傳穩(wěn)定性的重要工具；
- 植物表觀基因組編輯技術已基本具備從基礎研究走向育種應用；
- 不同靶位點的染色質環(huán)境（如RdDM通路活性）顯著影響工具選擇策略。
參考文獻：He L, Yao Y, You Y, Wei X, Ma Y, Yuan W, Lang Z, Zhu JK. Versatile molecular tools enabling customizable DNA methylation editing in Arabidopsis. Nat Commun. 2025 Dec 6. doi: 10.1038/s41467-025-66933-z.
