AF6敲除上調膽汁酸分泌促進CXCL14介導的HCC抗腫瘤免疫

主要技術
單細胞RNA測序（技術服務伯豪生物提供）

主要研究
1. AF6通過調控HNF4α抑制初級膽汁酸合成，敲除后抑制肝癌進展
Afadin（AF6）是一種在上皮組織中普遍表達的支架極性蛋白，支持細胞粘附、遷移、分化和存活�；�于之前的研究，作者猜測AF6基因可能是調控肝組織膽汁酸合成的關鍵因子。因此對肝細胞特異性敲除Af6（AF6⁻/⁻）肝癌小鼠進行RNA測序分析及分子實驗驗證，結果顯示AF6可與膽汁酸合成關鍵轉錄因子HNFα相互作用，通過核定位序列介導的核轉位抑制HNF4α的轉錄活性，進而下調CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1等初級膽汁酸合成限速酶的表達。AF6敲除后，這些酶的蛋白與mRNA水平顯著上調，肝臟內牛磺膽酸（T-CA）、β-鼠膽酸（β-MCA）等初級膽汁酸濃度大幅升高。表型分析顯示，AF6⁻/⁻小鼠腫瘤數量及腫瘤直徑顯著降低，肝脾重量等腫瘤負荷指標明顯改善，該表型在水動力轉染癌基因的多個肝癌模型中均得到驗證；而過表達AF6會加速腫瘤發(fā)展并降低肝臟膽汁酸水平，證實AF6通過調控初級膽汁酸合成介導肝癌進展。

圖1 AF6與HNF4α相互作用介導的膽汁酸合成改變影響肝癌進展

2. AF6敲除通過膽汁酸代謝重編程上調CXCL14 
作者重新分析AF6敲除肝癌小鼠的轉錄組數據，發(fā)現免疫相關通路顯著激活，其中趨化因子編碼基因CXCL14的上調幅度最為顯著，qPCR與ELISA實驗驗證了AF6⁻/⁻小鼠腫瘤組織中CXCL14 mRNA高表達，且血清中CXCL14蛋白濃度顯著升高，該結果在多種肝癌模型中均一致，而過表達AF6則會抑制CXCL14的表達，免疫熒光顯示CXCL14在AF6⁻/⁻小鼠腫瘤邊緣富集。為驗證CXCL14的功能，作者通過腺相關病毒（AAV-TBG-Cxcl14）在AF6 flox/flox肝癌小鼠中肝特異性過表達CXCL14，結果顯示腫瘤負荷顯著降低，腫瘤數量與肝重比明顯下降；而敲除AF6⁻/⁻小鼠的CXCL14會逆轉AF6敲除的抑瘤效應，加速肝癌進展，表明CXCL14是受AF6負調控、介導肝癌抑制的關鍵抑瘤性趨化因子。此外，給予AF6flox/flox肝癌小鼠1%T-CA飲食可模擬AF6敲除的表型，顯著抑制腫瘤進展并上調血清與腫瘤組織中的CXCL14，表明AF6調控的T-CA是CXCL14上調的重要上游信號。

圖2 CXCL14 在抑制肝癌進展中發(fā)揮重要作用

3. 膽汁酸通過重塑腸道菌群使丁酸水平升高，丁酸經腸肝軸介導CXCL14上調
體外實驗中，用T-CA、β-MCA等關鍵初級膽汁酸處理肝癌細胞系及患者來源肝癌類器官，并未直接誘導CXCL14表達，提示膽汁酸并非通過直接作用調控CXCL14。宏基因組測序顯示，AF6⁻/⁻肝癌小鼠腸道菌群組成發(fā)生顯著改變，雙歧桿菌、糞桿菌、擬桿菌、乳桿菌等短鏈脂肪酸（SCFA）產生菌屬顯著富集，靶向代謝組學檢測到小鼠肝臟中乙酸、丁酸等短鏈脂肪酸水平大幅升高。同時，AF6敲除后回腸與肝臟中ASBT、NTCP等膽汁酸轉運體的表達上調，增強了腸肝循環(huán)，過表達AF6則會降低丁酸水平并抑制轉運體表達，T-CA飲食可模擬AF6敲除的菌群與代謝物變化。體外功能實驗證實，丁酸可顯著上調肝癌細胞系及人、鼠肝癌類器官中CXCL14的mRNA與蛋白分泌水平，而乙酸、丙酸無此效應；體內實驗中，給野生型小鼠補充丁酸可使血清中的CXCL14升高，給肝癌小鼠補充丁酸則顯著抑制腫瘤進展，同時上調血清與肝臟CXCL14水平，證實膽汁酸通過重塑腸道菌群提升丁酸水平，丁酸是經腸肝軸介導CXCL14上調的關鍵中介。

圖3膽汁酸代謝改變腸道菌群組成，菌群來源的丁酸通過腸-肝軸促進 CXCL14 的表達

4. CXCL14通過招募并激活樹突狀細胞塑造抑瘤性腫瘤微環(huán)境
為明確CXCL14的抑瘤機制，作者對AF6敲除肝癌小鼠腫瘤組織進行單細胞RNA測序。結果顯示CXCL14主要由肝細胞表達，免疫熒光共定位實驗進一步證實肝細胞是CXCL14的分泌來源。細胞間通訊分析顯示CXCL14⁺細胞與樹突狀細胞（DC）、T細胞等免疫細胞存在強烈信號交互，流式細胞術檢測發(fā)現AF6⁻/⁻小鼠腫瘤內DC細胞比例顯著升高，而巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞無比例明顯變化。Transwell 遷移實驗證實，重組 Cxcl14 能有效誘導DC細胞的趨化作用，且經 Cxcl14 處理的DC細胞中MHC-II、CD80 和 CD86 的表達水平顯著升高。體內耗竭實驗中，用抗CD11c中和抗體耗竭AF6⁻/⁻小鼠的DC細胞后，肝臟丁酸與血清CXCL14水平未受影響，但AF6敲除的抑瘤效應完全消失，腫瘤數量與肝脾重量比顯著回升，證實CXCL14招募并激活DC細胞，是塑造抑瘤性腫瘤微環(huán)境的核心環(huán)節(jié)。

圖4 CXCL14 通過募集樹突狀細胞并增強其抗原提呈能力抑制肝癌進展

5. DC細胞介導CXCL14對CD8⁺T細胞的活化，AF6-BA-丁酸-CXCL14軸在人肝癌中具有臨床相關性
腫瘤組織單細胞RNA測序結果中的T細胞重聚類。分析顯示，AF6⁻/⁻小鼠腫瘤內效應增殖型CD8⁺T細胞亞群比例顯著升高，該亞群為主要的細胞毒性CD8⁺T細胞群體。流式細胞術證實，AF6⁻/⁻小鼠腫瘤浸潤CD8⁺T細胞的IFN-γ、TNF-α、GZMB等細胞毒性因子分泌增加，PD-1等耗竭標志物表達降低；體外共培養(yǎng)實驗顯示，CXCL14處理的DC細胞可顯著促進CD8⁺T細胞的增殖與細胞毒性因子分泌，而直接用CXCL14處理CD8⁺T細胞則無此效應，膽汁酸與丁酸也無法直接調控CD8⁺T細胞功能。CD8⁺T細胞耗竭后，AF6敲除的抑瘤效應被逆轉，證實CD8⁺T細胞是CXCL14-DC軸介導抗腫瘤免疫的關鍵效應細胞；過表達CXCL14可增加腫瘤內DC細胞浸潤與CD8⁺T細胞的細胞毒性，敲除CXCL14則會抑制CD8⁺T細胞功能。臨床樣本分析顯示，人肝癌組織中AF6表達顯著高于癌旁正常組織，且AF6高表達與不良預后相關，肝癌組織中丁酸水平低于正常肝組織并與AF6表達負相關，肝癌患者血清與腫瘤組織中CXCL14水平顯著降低，且AF6與CXCL14表達呈負相關，高CXCL14表達及低AF6/CXCL14比值與患者良好預后相關，證實AF6-膽汁酸-丁酸-CXCL14軸在人肝癌中高度保守，具有重要的臨床預后與治療意義。

圖5 膽汁酸代謝改變通過樹突狀細胞增強腫瘤微環(huán)境中 CD8⁺T 細胞的細胞毒性

參考文獻：
1. Xu K, Dong X, Qu H, et al (2026) AF6 knockout-induced upregulation of bile acid production promotes CXCL14-mediated antitumor immunity in HCC. J Hepatol S0168-8278(26)00016–4. https://doi.org/10.1016/j.jhep.2025.12.029