全自動移液工作站firefly®在高效的靶向測序中的應(yīng)用

二代測序（NGS）平臺正通過不斷提升通量、降低測序成本，持續(xù)推動技術(shù)革新。這一趨勢使得大規(guī)�；�因組學(xué)研究中的主要瓶頸已從測序本身轉(zhuǎn)移至文庫制備環(huán)節(jié)。尤其是在群體規(guī)�；�因組學(xué)與靶向測序應(yīng)用中，傳統(tǒng)手工文庫制備方法仍面臨流程繁瑣、耗時久、成本高等現(xiàn)實(shí)挑戰(zhàn)。

Twist 公司的FlexPrep™ 超高通量（UHT）文庫制備與雜交捕獲試劑盒憑借兩項(xiàng)核心創(chuàng)新，能有效應(yīng)對上述挑戰(zhàn)。首先，Normalization by Ligation™（NBL）技術(shù)消除了在文庫制備前對每個DNA樣本進(jìn)行定量和均一化（normalization）的要求，即能夠?qū)⒉煌�起始量的待測樣本穩(wěn)定轉(zhuǎn)化為可測序文庫；其次，在文庫構(gòu)建流程的前期便引入分子標(biāo)簽（barcode），使樣本在連接反應(yīng)后即可直接混合（pooling），從而大幅減少后續(xù)的實(shí)驗(yàn)流程步驟和反應(yīng)體系，所需的耗材和試劑用量可節(jié)省高達(dá)12倍。這些創(chuàng)新設(shè)計(jì)使得每個靶向捕獲反應(yīng)可同時支持96個樣品，在顯著降低試劑消耗與人工操作時間的同時，充分提升了測序平臺的運(yùn)行效率。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用了SPT Labtech的全自動移液工作站firefly® 來運(yùn)行Twist FlexPrep UHT文庫制備與雜交捕獲實(shí)驗(yàn)流程。實(shí)驗(yàn)選用了384個來自牛基因組DNA（Sigma Aldrich 36231-M）的樣品，并在384孔板的4個象限中分別投入了30、60、90和120 ng 4種不同的起始量，以此展現(xiàn)了firefly具有可拓展、無人值守化以及重復(fù)性高等特點(diǎn)，所得數(shù)據(jù)質(zhì)量經(jīng)驗(yàn)證與成熟的基因組分析方法結(jié)果相當(dāng)。

將Twist FlexPrep超高通量（UHT）文庫制備試劑盒、SPT Labtech公司的firefly平臺和Element Biosciences公司的Trinity™ 測序化學(xué)技術(shù)相結(jié)合，并運(yùn)用Twist Biosciences公司的�；�因組（Bovine DNA）捕獲Panel實(shí)現(xiàn)了"雜交-測序同步化"的靶向捕獲和富集。該工作流程為高通量基因組學(xué)研究提供了一個穩(wěn)定可靠、靈活高效且具有顯著成本優(yōu)勢的解決方案，能夠在大規(guī)模樣本隊(duì)列研究中對已知或未知的新型基因進(jìn)行高效檢測和分析。

圖1. 整合firefly平臺與Element Trinity™技術(shù)的自動化文庫制備、靶向富集及測序全流程示意圖

本圖展示了整合SPT Labtech firefly平臺與Element Biosciences Trinity™測序儀內(nèi)雜交捕獲及測序的全流程。gDNA樣本首先通過firefly平臺在384孔板上進(jìn)行片段化與連接反應(yīng)，并借助12個內(nèi)聯(lián)條形碼 （incline barcodes）在建庫前期即實(shí)現(xiàn)樣本混合。隨后，混合文庫在32個孔內(nèi)（384/12=32）中完成連接后的純化、PCR擴(kuò)增及SPRI純化，在維持文庫質(zhì)量的同時顯著減少了試劑用量和人工操作時間。完成質(zhì)控（QC）檢測后，文庫進(jìn)入Trinity工作流程，探針雜交捕獲直接在測序儀內(nèi)的卡盒芯片上進(jìn)行并完成測序。

FlexPrep™ NBL技術(shù)實(shí)現(xiàn)不同DNA起始量下穩(wěn)定的文庫產(chǎn)出


圖2. FlexPrep™ Normalization by Ligation ™ (NBL) 技術(shù)可在寬泛的DNA起始量范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的文庫產(chǎn)出

采用Twist Bioscience FlexPrep™ 超高通量文庫制備試劑盒，對30至300 ng起始量范圍內(nèi)的基因組DNA進(jìn)行文庫normalization性能評估。圖A：在不同DNA起始量下NGS測序reads數(shù)保持較高的均一性，從而避免繁瑣的DNA定量步驟。圖B: 在相同的DNA起始量范圍內(nèi)，插入片段大小中位數(shù)（median insert size）保持穩(wěn)定，體現(xiàn)了NBL技術(shù)在實(shí)現(xiàn)文庫產(chǎn)出均一化的同時，能夠維持目標(biāo)插入片段大小，并有效規(guī)避基于轉(zhuǎn)座酶方法常見的性能問題。

FlexPrep™ UHT文庫制備工作流程


圖3. 傳統(tǒng)酶切文庫制備流程與Twist FlexPrep™ UHT超高通量工作流程對比

傳統(tǒng)酶切文庫制備流程與Twist FlexPrep™ UHT文庫制備流程（96樣本）對比示意圖。傳統(tǒng)流程中，從DNA稀釋定量到片段化、連接、純化、PCR及最終質(zhì)控的每個步驟均需在獨(dú)立的96孔標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系中進(jìn)行。相比之下，F(xiàn)lexPrep™ UHT流程在連接反應(yīng)中引入了barcode，使樣本可在首次SPRI純化前完成混合。通過在前期將96個樣品混合至8個實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系，能夠在確保文庫質(zhì)量與一致性的同時，顯著減少試劑和耗材的消耗、人工操作時間及整體實(shí)驗(yàn)成本。

傳統(tǒng)雜交捕獲和Element Trinity™ 機(jī)內(nèi)雜交的流程對比


圖4. 傳統(tǒng)雜交捕獲流程與Element Trinity™測序儀內(nèi)雜交工作流程對比

本示意圖對比了常規(guī)外顯子組與靶向Panel測序所用的傳統(tǒng)雜交捕獲流程（上）與Element Biosciences公司Trinity™測序儀機(jī)內(nèi)雜交工作流程（下）。

傳統(tǒng)雜交捕獲需經(jīng)歷長時間的探針雜交、磁珠結(jié)合、多輪洗滌、雜交后擴(kuò)增、文庫質(zhì)控及混合等步驟，隨后才能進(jìn)行上機(jī)測序。相比之下，Trinity技術(shù)流程直接將雜交探針加載至測序儀的芯片中，省去了磁珠捕獲、洗滌及雜交后擴(kuò)增環(huán)節(jié)，從而精簡了靶向富集步驟。這一簡化的工作流程在保持高效靶向富集與穩(wěn)定測序性能的同時，顯著減少了人工操作時間、縮短了實(shí)驗(yàn)周期，并降低了流程復(fù)雜度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：文庫質(zhì)控（QC）數(shù)據(jù)


圖5. 不同基因組DNA起始濃度下的最終文庫產(chǎn)量

采用SPT Labtech firefly液體處理平臺自動化運(yùn)行的Twist FlexPrep™ 超高通量文庫制備與雜交試劑盒所得到的最終文庫產(chǎn)量（ng/μL）。

待測樣本選取了�；�因組DNA，按四種起始濃度（30、60、90及120 ng）分置于384孔板的四個象限中，以評估該體系流程對不同DNA起始濃度下文庫產(chǎn)出的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所有起始濃度下均得到了相當(dāng)均一的文庫產(chǎn)量，體現(xiàn)了Twist NBL技術(shù)在均一化中的高效性。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，在firefly平臺上自動化運(yùn)行Twist FlexPrep工作流程無需預(yù)先進(jìn)行DNA定量與均一化處理，即可實(shí)現(xiàn)高度穩(wěn)定的文庫制備重復(fù)性。

圖6. 不同gDNA起始濃度下文庫片段大小的一致性

通過firefly自動化Twist FlexPrep™ UHT工作流程，在四種基因組DNA起始濃度（30、60、90和120 ng）下制備的文庫所獲得的平均片段大小（bp）。

所有起始濃度下的文庫片段大小分布均保持一致，表明該流程體系具有穩(wěn)定且可重復(fù)的片段化與文庫制備能力，且不受起始樣本量的影響。這種高度均一性保障了文庫制備流程具備良好的可擴(kuò)展性與高通量適用性，能夠廣泛支持下游雜交、靶向富集及測序等各類應(yīng)用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：測序性能指標(biāo)


圖7. Trinity™ 測序儀“機(jī)內(nèi)雜交”的測序性能指標(biāo)

采用Twist FlexPrep™ UHT文庫制備流程、并通過Element Biosciences Trinity™測序儀進(jìn)行機(jī)內(nèi)雜交并測序，其靶向富集與測序性能指標(biāo)展示。

所列指標(biāo)包括：脫靶百分比、雜交文庫大小、重復(fù)序列百分比、平均靶向覆蓋深度、零覆蓋靶標(biāo)百分比及Fold-80堿基罰分。結(jié)果展示基于多個firefly自動化文庫制備的混合樣品批次。所有指標(biāo)表現(xiàn)一致，表明整合的firefly–Twist–Element工作流程能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定的雜交效率、均一的靶向覆蓋以及可重復(fù)的高質(zhì)量測序。