WGBS等助力揭示激活植物DNA甲基化基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵蛋白結(jié)合
大家好，這里是專注表觀組學十余年，領(lǐng)跑多組學科研服務(wù)的易基因。
在植物中，通常啟動子區(qū)域DNA甲基化和H3K9me2組蛋白修飾被認為是轉(zhuǎn)錄抑制標記。近日，內(nèi)蒙古大學李東明教授團隊發(fā)現(xiàn)植物中存在全新的表觀遺傳調(diào)控機制，即含有SAWADEE結(jié)構(gòu)域的蛋白SHH1（SAWADEE HOMEODOMAIN HOMOLOG 1）與DNA甲基化識別蛋白MBD7（METHYL-CpG-BINDING DOMAIN 7）形成協(xié)同作用模塊，共同識別DNA甲基化和組蛋白H3K9me2雙重表觀遺傳標記，從而促進啟動子甲基化基因表達，抑制轉(zhuǎn)錄沉默。此研究拓展了SHH1在經(jīng)典RNA介導(dǎo)DNA甲基化（RdDM）通路之外的新功能，為理解DNA甲基化在基因表達調(diào)控中的雙重作用提供了分子機制層面的新視角。相關(guān)研究成果以“SHH1 cooperates with the DNA methylation reader MBD7 to suppress transcriptional silencing of promoter-methylated genes in Arabidopsis”發(fā)表于《Plant Communications》期刊。
英文標題：SHH1 cooperates with the DNA methylation reader MBD7 to suppress transcriptional silencing of promoter-methylated genes in Arabidopsis
中文標題：SHH1與DNA甲基化識別蛋白MBD7協(xié)同抑制擬南芥中啟動子甲基化基因的轉(zhuǎn)錄沉默
發(fā)表時間：2026年1月12日
發(fā)表期刊：Plant Communications
影響因子：IF11.6/Q1
技術(shù)平臺：WGBS、RNA-seq
作者單位：內(nèi)蒙古大學
DOI:10.1016/j.xplc.2025.101545
在擬南芥中，甲基化CpG結(jié)合域蛋白7（MBD7）及其相關(guān)的α晶狀體結(jié)構(gòu)域（ACD）蛋白形成復(fù)合體，通過識別DNA甲基化以抑制甲基化熒光素酶（LUC）轉(zhuǎn)基因沉默，但MBD7復(fù)合體靶向甲基化轉(zhuǎn)基因的具體機制尚未闡明。在此，本研究揭示了SAWADEE同源異型域蛋白1（SHH1）的一個全新新功能，擴展了其經(jīng)典的RdDM通路。具體而言，研究團隊證明SHH1與MBD7在同一調(diào)控通路中協(xié)同作用，共同抑制甲基化LUC轉(zhuǎn)基因及部分內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄沉默。其中，SHH1與MBD7在細胞核焦點中共定位，并通過物理互作增強MBD7穩(wěn)定性。此外，SHH1通過其SAWADEE結(jié)構(gòu)域識別H3K9me2組蛋白標記，從而結(jié)合甲基化位點。這種互作促進了SHH1和MBD7富集于甲基化位點，揭示了一種維持啟動子甲基化基因轉(zhuǎn)錄活性的協(xié)同機制。綜上所述，本研究揭示了一個動態(tài)互補的SHH1-MBD7模塊，該模塊通過促進與帶有抑制性表觀遺傳修飾標記染色質(zhì)的有效結(jié)合，增強啟動子甲基化基因表達。研究為理解植物中DNA甲基化如何通過協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄抑制與激活的平衡來精細調(diào)控基因表達提供了重要見解。
易小結(jié)
本研究揭示的SHH1-MBD7協(xié)同識別機制，不僅豐富了植物表觀遺傳調(diào)控的分子機制，更為作物轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定性改良和精準育種提供了潛在靶點。
技術(shù)上，本研究充分展示了WGBS在解析表觀遺傳調(diào)控機制中的核心作用，通過單堿基分辨率繪制DNA甲基化圖譜，精確定量CG、CHG、CHH三種序列環(huán)境下的甲基化動態(tài)變化，為功能基因的表觀遺傳機制研究提供了不可或缺的技術(shù)支撐。
研究方法
（1）樣本材料
利用EMS誘變的YJ報告基因株系（在rdr6-11背景下表達d35S啟動子驅(qū)動的LUC基因）進行正向遺傳學篩選，鑒定出shh1-2突變體。通過遺傳雜交構(gòu)建了YJshh1-2 mbd7-4、YJshh1-2 lil-1、YJshh1-2 suvh1-1等雙突變體及各種互補轉(zhuǎn)基因株系（如SHH1-3×MYC/YJshh1-2、MBD7-3×FLAG/YJmbd7-4）。
（2）表型分析
使用活體熒光素酶成像系統(tǒng)檢測LUC報告基因的發(fā)光強度，通過RT-qPCR定量LUC及內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄本水平。
（3）表觀遺傳學分析
WGBS：從幼苗或胚胎中提取基因組DNA進行建庫測序，單堿基分辨率檢測CG、CHG、CHH中的胞嘧啶甲基化水平，鑒定差異甲基化區(qū)域（DMRs）。
染色質(zhì)免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）：定量檢測目標區(qū)域（如d35S啟動子、內(nèi)源基因啟動子）的H3K9me2修飾水平及蛋白-染色質(zhì)結(jié)合。
McrBC-PCR：驗證特定位點的甲基化狀態(tài)。
（4）轉(zhuǎn)錄組學分析
mRNA測序（mRNA-seq）分析YJ、YJshh1-2和YJmbd7-4胚胎及幼苗的差異表達基因（DEGs）。
（5）蛋白互作與定位分析
酵母雙雜交（Y2H）分析SHH1與MBD7的互作及結(jié)構(gòu)域定位；分裂熒光素酶互補（Split-LUC）實驗在煙草葉片中驗證蛋白互作；免疫共沉淀（Co-IP）實驗在植物體內(nèi)驗證互作；GST pull-down實驗驗證體外直接互作；免疫熒光分析蛋白亞細胞共定位；Western blot分析MBD7-3×FLAG在野生型和shh1-2突變體背景下的蛋白穩(wěn)定性。
關(guān)鍵結(jié)果
（1）SHH1抑制YJ報告基因轉(zhuǎn)錄沉默
研究團隊通過正向遺傳學篩選，在YJ報告株系背景下鑒定出一個新的突變體YJshh1-2，該突變體表現(xiàn)出LUC報告基因發(fā)光強度顯著減弱（圖1A）。RT-qPCR證實其LUC轉(zhuǎn)錄本水平顯著降低（圖1B）。通過遺傳互補實驗，將帶有原生啟動子的SHH1基因（融合eGFP、3×FLAG或3×MYC標簽）回補到Y(jié)Jshh1-2中，能夠完全恢復(fù)LUC的發(fā)光和表達（圖1D、E），證明表型確實由SHH1基因突變導(dǎo)致。此外，使用DNA甲基化抑制劑5-aza-2'-deoxycytidine (5-Aza-dC)處理YJshh1-2植株后，LUC表達得以恢復(fù)（圖1F、G），表明SHH1通過DNA甲基化通路調(diào)控LUC表達，提示其具有拮抗由DNA甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默功能。
（2）SHH1功能缺失導(dǎo)致YJ報告基因位點的CHH甲基化和H3K9me2水平降低
為探究SHH1突變對YJ報告基因表觀遺傳機制的作用，研究團隊對YJ和YJshh1-2植株進行了全基因組亞硫酸鹽測序（WGBS）分析，重點分析了促進LUC表達的d35S啟動子區(qū)域DNA甲基化。結(jié)果顯示，與YJ對照相比，YJshh1-2突變體在d35S啟動子區(qū)域的整體DNA甲基化輕微下降，其中非對稱CHH位點的甲基化水平下降最為顯著，降幅約40%（圖2A-B）。相反，CG甲基化略有增加，而CHG甲基化基本保持不變（圖2A），這可能與shh1突變體中ROS1表達降低有關(guān)。IGV圖清晰展示了YJ和YJshh1-2之間d35S啟動子區(qū)域甲基化分布的差異模式（圖2B）。McrBC-PCR實驗進一步驗證這一結(jié)果（圖2C）。
與此同時，ChIP-qPCR實驗顯示，YJshh1-2中與轉(zhuǎn)錄沉默密切相關(guān)的組蛋白標記H3K9me2在d35S啟動子的富集也顯著降低（圖2D），這些結(jié)果與SHH1在經(jīng)典RdDM通路中的作用一致。這些結(jié)果表明shh1突變破壞了YJ報告基因位點的CHH甲基化和H3K9me2沉積。然而這些抑制性標記減少與熒光素酶活性缺失形成對比，暗示SHH1除了其在RdDM中的經(jīng)典功能外，還可能具有拮抗DNA甲基化介導(dǎo)的基因沉默功能。
WGBS技術(shù)在單堿基分辨率下檢測到三種序列環(huán)境（CG、CHG、CHH）下的甲基化變化，特別是揭示了CHH甲基化的特異性降低，為理解SHH1在RdDM通路中的功能提供了直接證據(jù)。
（3）SHH1與MBD7在同一通路中發(fā)揮協(xié)同作用，以抑制YJ轉(zhuǎn)基因及部分內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄沉默
已知MBD7-ACD和SUVH1/3-DNAJ1/2是兩個能促進甲基化基因表達的DNA甲基化reader蛋白復(fù)合體。為確定SHH1屬于哪條通路，研究團隊構(gòu)建了YJshh1-2 mbd7-4、YJshh1-2 lil-1（LIL是MBD7-ACD復(fù)合體組分）和YJshh1-2 suvh1-1雙突變體。遺傳分析顯示，YJshh1-2 mbd7-4和YJshh1-2 lil-1雙突變體的LUC沉默表型相對于各自單突變體沒有疊加效應(yīng)（圖3A-D），而YJshh1-2 suvh1-1則表現(xiàn)出顯著的疊加效應(yīng)。表明SHH1很可能通過MBD7-ACD通路發(fā)揮作用。
為驗證其在內(nèi)源基因中的功能，研究團隊對YJ、YJshh1-2和YJmbd7-4的胚胎進行了mRNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)在YJshh1-2和YJmbd7-4中有927個共有下調(diào)基因（圖4A）。對這927個基因的啟動子甲基化與基因表達進行關(guān)聯(lián)分析，并未發(fā)現(xiàn)顯著的負相關(guān)性（圖4C），表明基因下調(diào)并非由啟動子甲基化增加介導(dǎo)。對其中10個代表基因在雙突變體中的表達分析也未見疊加效應(yīng)（圖4B），從而證實SHH1與MBD7在同一通路中協(xié)同抑制部分啟動子甲基化內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄沉默。
（4）SHH1與MBD7在體內(nèi)互作
為探究SHH1與MBD7協(xié)同作用的分子基礎(chǔ)，研究者進行了蛋白互作研究。酵母雙雜交實驗表明，全長SHH1及其C端SAWADEE結(jié)構(gòu)域能與MBD7直接互作，而N端同源域則不能（圖5A-B）。同樣，MBD7中與SHH1互作關(guān)鍵區(qū)域是其N端三個MBD結(jié)構(gòu)域，而非C端STKC結(jié)構(gòu)域（圖5B）。這一直接互作在煙草葉片的分裂熒光素酶互補實驗中得到進一步驗證（圖5C）。最關(guān)鍵的是，體內(nèi)Co-IP實驗證明，在同時表達SHH1-3×MYC和MBD7-3×FLAG的轉(zhuǎn)基因植株中，SHH1能夠與MBD7發(fā)生免疫共沉淀（圖5D）。此外，SAWADEE結(jié)構(gòu)域關(guān)鍵位點突變（Y140A、Y212A）會破壞SHH1與MBD7體內(nèi)互作，而同源域突變（K72A）則無影響（圖5E-F）。上述結(jié)果表明SAWADEE結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)SHH1與MBD7之間直接的物理相互作用。
（5）SHH1與MBD7共定位，且對MBD7的定位和穩(wěn)定性至關(guān)重要
免疫熒光實驗顯示，在細胞核內(nèi)，SHH1-3×MYC和MBD7-3×FLAG呈現(xiàn)出高度一致的定位模式，均在細胞核仁和細胞核質(zhì)中形成清晰的焦點，并且信號完全共定位（圖6A）。當在shh1-2突變體背景下觀察MBD7-3×FLAG時，發(fā)現(xiàn)85%的細胞核中MBD7失去這種特異焦點定位（圖6B）。Western blot分析進一步揭示，在shh1-2突變體中，MBD7-3×FLAG的蛋白水平顯著降低，而其轉(zhuǎn)錄本水平未變（圖6C）。這表明SHH1不僅負責將MBD7招募到特定的核內(nèi)結(jié)構(gòu)域，還對于維持MBD7的蛋白穩(wěn)定性具有關(guān)鍵作用。
（6）SAWADEE結(jié)構(gòu)域?qū)HH1功能至關(guān)重要，SHH1與MBD7在靶向甲基化位點中相互依賴
鑒于SAWADEE結(jié)構(gòu)域?qū)HH1-MBD7互作的重要性，研究團隊檢測了該結(jié)構(gòu)域突變是否影響SHH1抗沉默功能�；パa實驗表明，野生型SHH1和同源域突變體SHH1K72A能夠恢復(fù)YJshh1-2中LUC及三個代表內(nèi)源基因表達，而SAWADEE結(jié)構(gòu)域突變體SHH1Y140A和SHH1Y212A則完全不能（圖7A-B）。ChIP-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，野生型SHH1和SHH1K72A能有效結(jié)合到這些甲基化靶位點，而SHH1Y140A和SHH1Y212A則幾乎喪失染色質(zhì)結(jié)合能力（圖7C-D）。這些結(jié)果證明，SAWADEE結(jié)構(gòu)域是SHH1發(fā)揮功能及其靶向染色質(zhì)所必需的，其關(guān)鍵位點（Y140、Y212）可能直接參與識別H3K9me2或維持結(jié)構(gòu)域的正確構(gòu)象。
基于上述發(fā)現(xiàn)，研究團隊提出協(xié)同招募模型：SHH1和MBD7通過相互依賴方式共同結(jié)合到甲基化染色質(zhì)上，且ChIP實驗驗證這一模型。在shh1-2突變體或表達SHH1Y140A/Y212A植株中，MBD7在d35S啟動子和內(nèi)源基因靶位點的富集顯著降低（圖7E）；而在mbd7-4突變體中，SHH1在這些位點的富集也顯著減少（圖7F）。這表明SHH1與MBD7結(jié)合相互促進，兩者共同構(gòu)成穩(wěn)定的染色質(zhì)結(jié)合模塊。單獨任何一個蛋白都無法有效克服由DNA甲基化和H3K9me2共同造成的染色質(zhì)可及性限制，只有通過這種雙重識別機制，MBD7-ACD復(fù)合體才能穩(wěn)定駐留，進而激活基因表達（圖7G）。
圖7：SHH1的SAWADEE結(jié)構(gòu)域?qū)ζ淙旧|(zhì)結(jié)合至關(guān)重要。
結(jié)論和啟示
本研究通過WGBS和RNA-seq及一系列分子功能實驗，揭示了SHH1與MBD7形成一個相互依賴、相互強化的結(jié)合模塊，通過協(xié)同識別啟動子區(qū)域的DNA甲基化和H3K9me2雙重抑制標記，招募MBD7-ACD復(fù)合體，從而促進一系列啟動子甲基化基因的表達，實現(xiàn)抑制轉(zhuǎn)錄沉默的目的。這一機制為作物育種中穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因表達、利用表觀遺傳手段精準調(diào)控農(nóng)藝性狀提供了潛在的理論基礎(chǔ)和新靶點。
參考文獻：Lu Y, Jia S, Guo R, Wu M, Wang H, Gao S, Li Z, Ma Q, Hu Y, Liu C, Liu X, Wang T, Li H, Gao J, Jun L, Yang X, Li D. SHH1 cooperates with the DNA methylation reader MBD7 to suppress transcriptional silencing of promoter-methylated genes in Arabidopsis. Plant Commun. 2025 Oct 8:101545. doi: 10.1016/j.xplc.2025.101545.
在植物中，通常啟動子區(qū)域DNA甲基化和H3K9me2組蛋白修飾被認為是轉(zhuǎn)錄抑制標記。近日，內(nèi)蒙古大學李東明教授團隊發(fā)現(xiàn)植物中存在全新的表觀遺傳調(diào)控機制，即含有SAWADEE結(jié)構(gòu)域的蛋白SHH1（SAWADEE HOMEODOMAIN HOMOLOG 1）與DNA甲基化識別蛋白MBD7（METHYL-CpG-BINDING DOMAIN 7）形成協(xié)同作用模塊，共同識別DNA甲基化和組蛋白H3K9me2雙重表觀遺傳標記，從而促進啟動子甲基化基因表達，抑制轉(zhuǎn)錄沉默。此研究拓展了SHH1在經(jīng)典RNA介導(dǎo)DNA甲基化（RdDM）通路之外的新功能，為理解DNA甲基化在基因表達調(diào)控中的雙重作用提供了分子機制層面的新視角。相關(guān)研究成果以“SHH1 cooperates with the DNA methylation reader MBD7 to suppress transcriptional silencing of promoter-methylated genes in Arabidopsis”發(fā)表于《Plant Communications》期刊。
英文標題：SHH1 cooperates with the DNA methylation reader MBD7 to suppress transcriptional silencing of promoter-methylated genes in Arabidopsis
中文標題：SHH1與DNA甲基化識別蛋白MBD7協(xié)同抑制擬南芥中啟動子甲基化基因的轉(zhuǎn)錄沉默
發(fā)表時間：2026年1月12日
發(fā)表期刊：Plant Communications
影響因子：IF11.6/Q1
技術(shù)平臺：WGBS、RNA-seq
作者單位：內(nèi)蒙古大學
DOI:10.1016/j.xplc.2025.101545
在擬南芥中，甲基化CpG結(jié)合域蛋白7（MBD7）及其相關(guān)的α晶狀體結(jié)構(gòu)域（ACD）蛋白形成復(fù)合體，通過識別DNA甲基化以抑制甲基化熒光素酶（LUC）轉(zhuǎn)基因沉默，但MBD7復(fù)合體靶向甲基化轉(zhuǎn)基因的具體機制尚未闡明。在此，本研究揭示了SAWADEE同源異型域蛋白1（SHH1）的一個全新新功能，擴展了其經(jīng)典的RdDM通路。具體而言，研究團隊證明SHH1與MBD7在同一調(diào)控通路中協(xié)同作用，共同抑制甲基化LUC轉(zhuǎn)基因及部分內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄沉默。其中，SHH1與MBD7在細胞核焦點中共定位，并通過物理互作增強MBD7穩(wěn)定性。此外，SHH1通過其SAWADEE結(jié)構(gòu)域識別H3K9me2組蛋白標記，從而結(jié)合甲基化位點。這種互作促進了SHH1和MBD7富集于甲基化位點，揭示了一種維持啟動子甲基化基因轉(zhuǎn)錄活性的協(xié)同機制。綜上所述，本研究揭示了一個動態(tài)互補的SHH1-MBD7模塊，該模塊通過促進與帶有抑制性表觀遺傳修飾標記染色質(zhì)的有效結(jié)合，增強啟動子甲基化基因表達。研究為理解植物中DNA甲基化如何通過協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄抑制與激活的平衡來精細調(diào)控基因表達提供了重要見解。
易小結(jié)
本研究揭示的SHH1-MBD7協(xié)同識別機制，不僅豐富了植物表觀遺傳調(diào)控的分子機制，更為作物轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定性改良和精準育種提供了潛在靶點。
技術(shù)上，本研究充分展示了WGBS在解析表觀遺傳調(diào)控機制中的核心作用，通過單堿基分辨率繪制DNA甲基化圖譜，精確定量CG、CHG、CHH三種序列環(huán)境下的甲基化動態(tài)變化，為功能基因的表觀遺傳機制研究提供了不可或缺的技術(shù)支撐。
研究方法
（1）樣本材料
利用EMS誘變的YJ報告基因株系（在rdr6-11背景下表達d35S啟動子驅(qū)動的LUC基因）進行正向遺傳學篩選，鑒定出shh1-2突變體。通過遺傳雜交構(gòu)建了YJshh1-2 mbd7-4、YJshh1-2 lil-1、YJshh1-2 suvh1-1等雙突變體及各種互補轉(zhuǎn)基因株系（如SHH1-3×MYC/YJshh1-2、MBD7-3×FLAG/YJmbd7-4）。
（2）表型分析
使用活體熒光素酶成像系統(tǒng)檢測LUC報告基因的發(fā)光強度，通過RT-qPCR定量LUC及內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄本水平。
（3）表觀遺傳學分析
WGBS：從幼苗或胚胎中提取基因組DNA進行建庫測序，單堿基分辨率檢測CG、CHG、CHH中的胞嘧啶甲基化水平，鑒定差異甲基化區(qū)域（DMRs）。
染色質(zhì)免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）：定量檢測目標區(qū)域（如d35S啟動子、內(nèi)源基因啟動子）的H3K9me2修飾水平及蛋白-染色質(zhì)結(jié)合。
McrBC-PCR：驗證特定位點的甲基化狀態(tài)。
（4）轉(zhuǎn)錄組學分析
mRNA測序（mRNA-seq）分析YJ、YJshh1-2和YJmbd7-4胚胎及幼苗的差異表達基因（DEGs）。
（5）蛋白互作與定位分析
酵母雙雜交（Y2H）分析SHH1與MBD7的互作及結(jié)構(gòu)域定位；分裂熒光素酶互補（Split-LUC）實驗在煙草葉片中驗證蛋白互作；免疫共沉淀（Co-IP）實驗在植物體內(nèi)驗證互作；GST pull-down實驗驗證體外直接互作；免疫熒光分析蛋白亞細胞共定位；Western blot分析MBD7-3×FLAG在野生型和shh1-2突變體背景下的蛋白穩(wěn)定性。
關(guān)鍵結(jié)果
（1）SHH1抑制YJ報告基因轉(zhuǎn)錄沉默
研究團隊通過正向遺傳學篩選，在YJ報告株系背景下鑒定出一個新的突變體YJshh1-2，該突變體表現(xiàn)出LUC報告基因發(fā)光強度顯著減弱（圖1A）。RT-qPCR證實其LUC轉(zhuǎn)錄本水平顯著降低（圖1B）。通過遺傳互補實驗，將帶有原生啟動子的SHH1基因（融合eGFP、3×FLAG或3×MYC標簽）回補到Y(jié)Jshh1-2中，能夠完全恢復(fù)LUC的發(fā)光和表達（圖1D、E），證明表型確實由SHH1基因突變導(dǎo)致。此外，使用DNA甲基化抑制劑5-aza-2'-deoxycytidine (5-Aza-dC)處理YJshh1-2植株后，LUC表達得以恢復(fù)（圖1F、G），表明SHH1通過DNA甲基化通路調(diào)控LUC表達，提示其具有拮抗由DNA甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默功能。
圖1：SHH1突變體表征
（2）SHH1功能缺失導(dǎo)致YJ報告基因位點的CHH甲基化和H3K9me2水平降低
為探究SHH1突變對YJ報告基因表觀遺傳機制的作用，研究團隊對YJ和YJshh1-2植株進行了全基因組亞硫酸鹽測序（WGBS）分析，重點分析了促進LUC表達的d35S啟動子區(qū)域DNA甲基化。結(jié)果顯示，與YJ對照相比，YJshh1-2突變體在d35S啟動子區(qū)域的整體DNA甲基化輕微下降，其中非對稱CHH位點的甲基化水平下降最為顯著，降幅約40%（圖2A-B）。相反，CG甲基化略有增加，而CHG甲基化基本保持不變（圖2A），這可能與shh1突變體中ROS1表達降低有關(guān)。IGV圖清晰展示了YJ和YJshh1-2之間d35S啟動子區(qū)域甲基化分布的差異模式（圖2B）。McrBC-PCR實驗進一步驗證這一結(jié)果（圖2C）。
與此同時，ChIP-qPCR實驗顯示，YJshh1-2中與轉(zhuǎn)錄沉默密切相關(guān)的組蛋白標記H3K9me2在d35S啟動子的富集也顯著降低（圖2D），這些結(jié)果與SHH1在經(jīng)典RdDM通路中的作用一致。這些結(jié)果表明shh1突變破壞了YJ報告基因位點的CHH甲基化和H3K9me2沉積。然而這些抑制性標記減少與熒光素酶活性缺失形成對比，暗示SHH1除了其在RdDM中的經(jīng)典功能外，還可能具有拮抗DNA甲基化介導(dǎo)的基因沉默功能。
WGBS技術(shù)在單堿基分辨率下檢測到三種序列環(huán)境（CG、CHG、CHH）下的甲基化變化，特別是揭示了CHH甲基化的特異性降低，為理解SHH1在RdDM通路中的功能提供了直接證據(jù)。
圖2：SHH1突變對d35S啟動子區(qū)域DNA甲基化及H3K9me2水平的影響。
（3）SHH1與MBD7在同一通路中發(fā)揮協(xié)同作用，以抑制YJ轉(zhuǎn)基因及部分內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄沉默
已知MBD7-ACD和SUVH1/3-DNAJ1/2是兩個能促進甲基化基因表達的DNA甲基化reader蛋白復(fù)合體。為確定SHH1屬于哪條通路，研究團隊構(gòu)建了YJshh1-2 mbd7-4、YJshh1-2 lil-1（LIL是MBD7-ACD復(fù)合體組分）和YJshh1-2 suvh1-1雙突變體。遺傳分析顯示，YJshh1-2 mbd7-4和YJshh1-2 lil-1雙突變體的LUC沉默表型相對于各自單突變體沒有疊加效應(yīng)（圖3A-D），而YJshh1-2 suvh1-1則表現(xiàn)出顯著的疊加效應(yīng)。表明SHH1很可能通過MBD7-ACD通路發(fā)揮作用。
為驗證其在內(nèi)源基因中的功能，研究團隊對YJ、YJshh1-2和YJmbd7-4的胚胎進行了mRNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)在YJshh1-2和YJmbd7-4中有927個共有下調(diào)基因（圖4A）。對這927個基因的啟動子甲基化與基因表達進行關(guān)聯(lián)分析，并未發(fā)現(xiàn)顯著的負相關(guān)性（圖4C），表明基因下調(diào)并非由啟動子甲基化增加介導(dǎo)。對其中10個代表基因在雙突變體中的表達分析也未見疊加效應(yīng)（圖4B），從而證實SHH1與MBD7在同一通路中協(xié)同抑制部分啟動子甲基化內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄沉默。
圖3：SHH1與MBD7–LIL通路的關(guān)系。
圖4：SHH1與MBD7在內(nèi)源基因拮抗沉默中的功能。
（4）SHH1與MBD7在體內(nèi)互作
為探究SHH1與MBD7協(xié)同作用的分子基礎(chǔ)，研究者進行了蛋白互作研究。酵母雙雜交實驗表明，全長SHH1及其C端SAWADEE結(jié)構(gòu)域能與MBD7直接互作，而N端同源域則不能（圖5A-B）。同樣，MBD7中與SHH1互作關(guān)鍵區(qū)域是其N端三個MBD結(jié)構(gòu)域，而非C端STKC結(jié)構(gòu)域（圖5B）。這一直接互作在煙草葉片的分裂熒光素酶互補實驗中得到進一步驗證（圖5C）。最關(guān)鍵的是，體內(nèi)Co-IP實驗證明，在同時表達SHH1-3×MYC和MBD7-3×FLAG的轉(zhuǎn)基因植株中，SHH1能夠與MBD7發(fā)生免疫共沉淀（圖5D）。此外，SAWADEE結(jié)構(gòu)域關(guān)鍵位點突變（Y140A、Y212A）會破壞SHH1與MBD7體內(nèi)互作，而同源域突變（K72A）則無影響（圖5E-F）。上述結(jié)果表明SAWADEE結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)SHH1與MBD7之間直接的物理相互作用。
圖5：SHH1與MBD7發(fā)生物理互作。
（5）SHH1與MBD7共定位，且對MBD7的定位和穩(wěn)定性至關(guān)重要
免疫熒光實驗顯示，在細胞核內(nèi)，SHH1-3×MYC和MBD7-3×FLAG呈現(xiàn)出高度一致的定位模式，均在細胞核仁和細胞核質(zhì)中形成清晰的焦點，并且信號完全共定位（圖6A）。當在shh1-2突變體背景下觀察MBD7-3×FLAG時，發(fā)現(xiàn)85%的細胞核中MBD7失去這種特異焦點定位（圖6B）。Western blot分析進一步揭示，在shh1-2突變體中，MBD7-3×FLAG的蛋白水平顯著降低，而其轉(zhuǎn)錄本水平未變（圖6C）。這表明SHH1不僅負責將MBD7招募到特定的核內(nèi)結(jié)構(gòu)域，還對于維持MBD7的蛋白穩(wěn)定性具有關(guān)鍵作用。
圖6：SHH1與MBD7共定位，影響MBD7蛋白穩(wěn)定性。
（6）SAWADEE結(jié)構(gòu)域?qū)HH1功能至關(guān)重要，SHH1與MBD7在靶向甲基化位點中相互依賴
鑒于SAWADEE結(jié)構(gòu)域?qū)HH1-MBD7互作的重要性，研究團隊檢測了該結(jié)構(gòu)域突變是否影響SHH1抗沉默功能�；パa實驗表明，野生型SHH1和同源域突變體SHH1K72A能夠恢復(fù)YJshh1-2中LUC及三個代表內(nèi)源基因表達，而SAWADEE結(jié)構(gòu)域突變體SHH1Y140A和SHH1Y212A則完全不能（圖7A-B）。ChIP-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，野生型SHH1和SHH1K72A能有效結(jié)合到這些甲基化靶位點，而SHH1Y140A和SHH1Y212A則幾乎喪失染色質(zhì)結(jié)合能力（圖7C-D）。這些結(jié)果證明，SAWADEE結(jié)構(gòu)域是SHH1發(fā)揮功能及其靶向染色質(zhì)所必需的，其關(guān)鍵位點（Y140、Y212）可能直接參與識別H3K9me2或維持結(jié)構(gòu)域的正確構(gòu)象。
基于上述發(fā)現(xiàn)，研究團隊提出協(xié)同招募模型：SHH1和MBD7通過相互依賴方式共同結(jié)合到甲基化染色質(zhì)上，且ChIP實驗驗證這一模型。在shh1-2突變體或表達SHH1Y140A/Y212A植株中，MBD7在d35S啟動子和內(nèi)源基因靶位點的富集顯著降低（圖7E）；而在mbd7-4突變體中，SHH1在這些位點的富集也顯著減少（圖7F）。這表明SHH1與MBD7結(jié)合相互促進，兩者共同構(gòu)成穩(wěn)定的染色質(zhì)結(jié)合模塊。單獨任何一個蛋白都無法有效克服由DNA甲基化和H3K9me2共同造成的染色質(zhì)可及性限制，只有通過這種雙重識別機制，MBD7-ACD復(fù)合體才能穩(wěn)定駐留，進而激活基因表達（圖7G）。
結(jié)論和啟示
本研究通過WGBS和RNA-seq及一系列分子功能實驗，揭示了SHH1與MBD7形成一個相互依賴、相互強化的結(jié)合模塊，通過協(xié)同識別啟動子區(qū)域的DNA甲基化和H3K9me2雙重抑制標記，招募MBD7-ACD復(fù)合體，從而促進一系列啟動子甲基化基因的表達，實現(xiàn)抑制轉(zhuǎn)錄沉默的目的。這一機制為作物育種中穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因表達、利用表觀遺傳手段精準調(diào)控農(nóng)藝性狀提供了潛在的理論基礎(chǔ)和新靶點。
參考文獻：Lu Y, Jia S, Guo R, Wu M, Wang H, Gao S, Li Z, Ma Q, Hu Y, Liu C, Liu X, Wang T, Li H, Gao J, Jun L, Yang X, Li D. SHH1 cooperates with the DNA methylation reader MBD7 to suppress transcriptional silencing of promoter-methylated genes in Arabidopsis. Plant Commun. 2025 Oct 8:101545. doi: 10.1016/j.xplc.2025.101545.
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