NCB文獻解讀：H3K36me2在植入后胚胎DNA甲基化重建中的調控機制
大家好，這里是專注表觀組學十余年，領跑多組學科研服務的易基因。
近日，山東大學盧緒坤副研究員、清華大學頡偉教授和復旦大學張宇青年研究員團隊合作，通過全基因組DNA甲基化測序（WGBS）、染色質免疫共沉淀測序（ChIP-seq）和轉錄組測序（Smart-seq）等分析系統(tǒng)揭示了組蛋白修飾H3K36me2在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中的動態(tài)重編程規(guī)律及其對胚胎植入后譜系特異性de novo DNA甲基化中的關鍵調控作用。相關研究成果以“Reprogramming of H3K36me2 guides lineage-specific post-implantation de novo DNA methylation”為題發(fā)表于《Nature Cell Biology 》期刊。
研究通過STAR ChIP-seq和WGBS等高通量測序技術，繪制了從卵母細胞到植入后胚胎的H3K36me2全基因組圖譜，并發(fā)現(xiàn)H3K36me2在合子基因組（ZGA）激活后分兩步重建（de novo）：首先在ZGA后定位于增強子區(qū)域，隨后在植入后擴散至全基因組（除失活X染色體外）。有趣的是，這種重編程通過差異性調控DNMT3A和DNMT3B兩種DNA甲基轉移酶，實現(xiàn)對胚胎譜系（高甲基化）和胚外譜系（部分甲基化）以及特定位點（生殖系基因啟動子）DNA甲基化建立的精準調控。本研究結果為理解哺乳動物表觀遺傳重編程機制提供了重要理論依據(jù)。
英文標題：Reprogramming of H3K36me2 guides lineage-specific post-implantation de novo DNA methylation
中文標題：H3K36me2重編程調控譜系特異性植入后的de novo DNA甲基化
發(fā)表時間：2025年11月11日
發(fā)表期刊：Nature Cell Biology
影響因子：IF19.1/Q1
技術平臺：ChIP-seq、WGBS、Smart-seq2
作者單位：山東大學、清華大學、復旦大學
DOI:10.1038/s41556-025-01805-8
廣泛所知，哺乳動物在受精后會經歷全局DNA去甲基化，隨后在胚胎植入后重建，但其背后分子機制尚未完全闡明。本研究探究了小鼠早期發(fā)育過程中H3K36me2重編程規(guī)律及其在植入后DNA甲基化重建中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在卵母細胞中，H3K36me2伴隨轉錄沉默主要在基因體區(qū)域積累，并部分維持至8細胞期；當合子基因組激活后，H3K36me2在增強子區(qū)域重建，隨后在植入后擴散至全基因組。此外，H3K36me2甲基轉移酶NSD1突變會損害植入后的全局DNA甲基化，尤其在胚外譜系以及易甲基化的啟動子區(qū)域表現(xiàn)顯著。同時，DNA甲基化建立可通過DNMT3B上調且存在部分不依賴于H3K36me2，即沒有H3K36me2/3仍能發(fā)揮一定作用；與之相對的，DNMT3A通過PWWP結構域并嚴格依賴H3K36me2/3才能進行DNA甲基化。最后，研究還發(fā)現(xiàn)DNA甲基化谷（DMVs）通過PRC1/H2AK119ub1介導的H3K36me2排斥機制避免了de novo DNA甲基化。因此，H3K36me2重編程調控了譜系特異性和位點特異性的植入后DNA甲基化建立。
易小結
本研究系統(tǒng)闡明了H3K36me2連接組蛋白修飾與DNA甲基化兩種關鍵表觀遺傳標記的分子機制，填補了植入后DNA甲基化重建調控機制的研究空白，對生殖醫(yī)學、發(fā)育生物學及表觀遺傳疾病機理研究具有重要指導價值。
技術上，本研究充分發(fā)揮WGBS和ChIP-seq協(xié)同優(yōu)勢，構建從染色質狀態(tài)到DNA甲基化的完整調控機制，為解析動態(tài)、微量樣本的表觀遺傳多組學整合策略在揭示復雜生物學過程中的重要作用，為未來探索其他發(fā)育或疾病模型中的表觀調控機制提供可借鑒的研究思路。
研究方法
（1）小鼠模型和樣本處理：
利用C57BL/6N和PWK/PhJ品系小鼠，收集從卵母細胞到胚胎第8.5天（E8.5）的各個發(fā)育階段樣本；分離囊胚的內細胞團（ICM）和滋養(yǎng)層（TE），并獲得植入后胚胎的胚胎外胚層（Epi）和胚外外胚層（ExE）譜系組織；構建催化結構域關鍵位點缺失的Nsd1基因敲除（KO）小鼠。
（2）關鍵分子機制探索：
STAR ChIP-seq：對微量樣本（如卵母細胞、早期胚胎）進行H3K36me2、H3K36me3、H3K27ac、H3K27me3、H2AK119ub1等組蛋白修飾的全基因組定位分析。
全基因組甲基化測序（WGBS）：對胚胎和組織樣本進行全基因組DNA甲基化檢測，以評估不同發(fā)育階段和基因型下的甲基化動態(tài)。
微量RNA-seq（Smart-seq2）：分析基因表達變化，并與表觀修飾數(shù)據(jù)關聯(lián)。
（3）體外實驗：
利用小鼠胚胎干細胞（mESCs），通過基因編輯（CRISPR-Cas9）構建Nsd1敲除、PRC1核心組分（RING1A/B）缺失、以及DNMT3A/3B/TET等多基因敲除的細胞系。在體外模擬從“初始態(tài)”到“形成態(tài)”多能性轉變（2i到EpiLCs），研究DNA甲基化建立過程。
（4）藥理學干預：
使用轉錄抑制劑（α-amanitin, DRB）、細胞周期抑制劑（aphidicolin）、組蛋白乙�；种苿ˋ-485）等處理胚胎，探究轉錄、細胞周期、組蛋白修飾對H3K36me2重編程的作用。
（5）分子生物學與生化實驗：
免疫熒光染色、蛋白質免疫印跡（Western Blot）、過表達DNMT3A/3B及其PWWP結構域缺失突變體等，驗證蛋白表達、定位及功能。
關鍵結果
（1）H3K36me2在小鼠早期發(fā)育過程中動態(tài)重編程及卵母細胞中轉錄依賴性的H3K36me2/3動態(tài)變化
研究團隊首先通過免疫染色和STAR ChIP-seq技術（圖1a）繪制了從卵母細胞到植入后胚胎的H3K36me2全基因組分布圖譜。研究結果發(fā)現(xiàn)，H3K36me2動態(tài)變化與H3K36me3（始終位于活躍基因體）存在顯著差異。在卵母細胞和植入前胚胎中，H3K36me2主要存在于基因體區(qū)域（圖1a藍色陰影），而在ZGA后， H3K36me2開始出現(xiàn)在增強子區(qū)域（圖1a紅色陰影及黑色箭頭），并在植入后擴展至全基因組的基因間區(qū)域（圖1a綠色陰影），類似于小鼠胚胎干細胞（mESCs）和體細胞中的模式。
在卵母細胞成熟過程中，H3K36me2和H3K36me3的分布與轉錄狀態(tài)密切相關。在轉錄活躍的非包繞核仁(non-surrounded nucleolus,NSN)的成熟卵母細胞（full-grown oocyte,FGO)中，H3K36me3高度富集于活躍基因體，而H3K36me2水平較低（圖1b-c）。隨著卵母細胞成熟至轉錄沉默的包繞核仁（SN）FGO和MII期，基因體上的H3K36me2增加，H3K36me3減少（圖1b-c）。使用轉錄抑制劑DRB處理NSN卵母細胞，可以介導活躍基因體上H3K36me2增加和H3K36me3減少（圖1d-e），證實了這種動態(tài)的轉錄依賴性。上述發(fā)現(xiàn)解釋了卵母細胞特異性DNA甲基化模式的建立機制，即H3K36me3主導轉錄活躍區(qū)域的DNA甲基化，而H3K36me2可能在其他區(qū)域發(fā)揮作用。
（2）父源H3K36me2在早期合子中缺失，而母源H3K36me2在植入前發(fā)育中緩慢減少，ZGA后轉錄關聯(lián)的H3K36me2重編程
通過等位基因特異性ChIP-seq分析，研究精確追蹤了雙親本H3K36me2命運（圖2）。結果顯示，父源H3K36me2在受精后的早期合子中幾乎完全缺失（與免疫染色結果一致），隨后逐漸重建。而母源H3K36me2在1-8細胞期胚胎中被短暫繼承，其模式與MII期卵母細胞相似，之后逐漸減弱。因此，在囊胚ICM之前，全基因組范圍的H3K36me2呈現(xiàn)母源偏向。這種雙親本差異導致早期胚胎中H3K36me2存在顯著的母源偏倚，直至ICM階段才實現(xiàn)等位基因平衡。對于卵母細胞特異性基因，母源H3K36me2可維持至8細胞階段，而H3K36me3在MII期即已丟失，提示兩種修飾具有不同的染色質繼承穩(wěn)定性。這一發(fā)現(xiàn)揭示了早期胚胎中表觀遺傳信息的不對稱傳遞模式。
ZGA標志著胚胎從母源調控向合子調控轉換，研究深入分析了此階段H3K36me2的重編程機制。在主要ZGA基因和持家基因（HK）中，ZGA后基因體區(qū)域出現(xiàn)H3K36me2相對缺失，而側翼區(qū)域出現(xiàn)H3K36me2重建（圖2b-c）。使用α-amanitin抑制轉錄可阻止2細胞期和8細胞期胚胎中ZGA基因和持家基因區(qū)域H3K36me2的這種重編程（圖2d-e）。表明ZGA后基因體上的H3K36me2重編程依賴于合子轉錄。
（3）H3K36me2在ZGA后于推定的增強子區(qū)域重建，H3K36me2在失活X染色體上缺失，并在X染色體再激活后于增強子區(qū)域重現(xiàn)
研究發(fā)現(xiàn)了H3K36me2重編程的關鍵特征。分析發(fā)現(xiàn)，ZGA后H3K36me2與增強子標記H3K27ac的共定位顯著增強，相關性從1細胞期的R=0.28升至8細胞期的R=0.79（圖3a-b）。 遠端H3K27ac峰在8細胞期被H3K36me2優(yōu)先標記（圖3a底部）。使用A-485抑制P300/CBP介導的組蛋白乙�；�，特異性地損害了8細胞期胚胎中H3K27ac富集區(qū)域的H3K36me2重建（圖3c-d），表明組蛋白乙�；糠纸閷3K36me2向增強子招募。但H3K36me2在植入前并未擴散至全基因組，其限制因子尚不完全清楚，可能存在其他調控機制。
在經歷印記X染色體失活（XCI）的胚外譜系中，失活的父源X染色體（Xp）在植入前發(fā)育全階段始終維持極低的H3K36me2水平（圖3e）。在體外來源的胚外內胚層（XEN）細胞中，沉默Xist導致失活X染色體部分再激活，伴隨H3K36me2在Xp上顯著增加，且與H3K27ac獲得和H2AK119ub1/H3K27me3減少密切相關（圖3f）。再激活后出現(xiàn)的H3K36me2峰靠近去抑制基因，提示其與增強子活性和基因激活相關。這一發(fā)現(xiàn)表明XCI狀態(tài)通過PRC1介導的H2AK119ub1和PRC2介導的H3K27me3排斥H3K36me2，維持Xi的表觀遺傳沉默。
（4）H3K36me2與胚外譜系中DNA甲基化建立相關性更強
研究利用已發(fā)表的野生型及Dnmt3a和Dnmt3b敲除胚胎數(shù)據(jù)，分析了H3K36me2/3與植入后DNA甲基化建立的相關性。在胚胎譜系(Epi)中中，野生型胚胎從ICM到E6.5的DNA甲基化增益與H3K36me3相關性較弱（R=0.08），與H3K36me2相關性中等（R=0.33）。Dnmt3b敲除后，DNMT3A依賴的DNA甲基化與H3K36me2/3的相關性顯著增強（H3K36me2: R=0.50；H3K36me3: R=0.38），而Dnmt3a敲除后DNMT3B依賴的DNA甲基化與H3K36me2/3相關性仍較低（圖4c-d）。相比之下，在胚外譜系（ExE）中，無論是野生型還是僅存在一種DNMT的情況下，DNA甲基化增益與H3K36me2/3相關性都更強（圖4c,f-g）。進一步分析顯示，DNMT3A和DNMT3B主要甲基化H3K36me2/3標記區(qū)域，而H3K36me2/3低的區(qū)域則更多地依賴于DNMT3B（圖4e）。這表明胚外譜系更依賴H3K36me2/3指導的DNA甲基化建立，可能與該譜系中Dnmt3a/3b表達水平較低有關。
圖4：與胚胎譜系相比，H3K36me2在胚外譜系中與DNA甲基化（DNAme）建立的相關性更強。
（5）H3K36me2調控體內植入后DNA甲基化建立，H3K36me2促進包括生殖系基因在內的啟動子區(qū)域甲基化
通過建立Nsd1催化失活突變小鼠模型，研究直接驗證了H3K36me2在體內的功能。Nsd1敲除導致胚胎從E6.5起出現(xiàn)嚴重生長遲緩，E8.5前致死（圖5a-b）。H3K36me2在E6.5胚胎中整體丟失，主要影響非轉錄區(qū)域（圖5c）。WGBS分析顯示，突變體胚胎中H3K36me2富集區(qū)域的DNA甲基化在胚胎譜系中中度下降，但在胚外譜系中缺失顯著（圖5c-d）。而H3K36me3富集區(qū)域的DNA甲基化幾乎不受影響，提示DNMT3A/3B在H3K36me2缺失時被重定向至H3K36me3標記區(qū)域。DNA甲基化缺失趨勢從E6.5到E8.5在胚胎譜系中逐漸減小，但在胚外譜系中加�。▓D5d），與兩種譜系中Dnmt3b表達差異相一致。上述研究結果表明在胚外譜系中，H3K36me2對植入后DNA甲基化建立至關重要。
研究者關注了一類對DNA甲基化敏感的生殖系基因（DMS germline genes）。WGBS分析顯示，在E6.5胚胎譜系中，Nsd1敲除導致這些基因的CpG島和非CpG島啟動子甲基化降低，在胚外譜系中也觀察到類似的啟動子低甲基化和部分基因去抑制（圖5e）。RNA-seq(Smart-seq2)分析發(fā)現(xiàn)Nsd1敲除的E6.5 Epi中有1158個基因上調、737個下調，上調基因顯著富集于減數(shù)分裂細胞周期和piRNA代謝通路，包括Piwil2、Ddx4、Asz1、Sohlh2、Sycp1等生殖系特異性基因；其中67個（48.9%）DMS生殖系基因上調表達，如Sohlh2和Tex19.1（圖5f-g）。這種啟動子低甲基化和基因去抑制狀態(tài)持續(xù)至E8.5。值得注意的是，在野生型胚胎中，DMS生殖系基因啟動子上的H3K36me2水平高于所有啟動子的平均水平。表明H3K36me2促進了植入后胚胎中啟動子（包括生殖系基因啟動子）甲基化維持生殖系基因的沉默狀態(tài)，防止其過早表達。
圖5：H3K36me2在體內調控植入后DNA甲基化（DNAme）建立。
（6）H3K36me2調控體外“初始態(tài)”向“形成態(tài)”多能性轉變過程中的高效de novo DNA甲基化
研究利用2i mES細胞向EpiLCs分化的體外模型模擬“初始態(tài)”（naive）向“形成態(tài)”（formative）轉變（2i mESCs向EpiLCs分化）。結果顯示，Nsd1敲除在2i mES細胞中導致H3K36me2幾乎完全缺失，剩余信號僅存在于H3K36me3富集的活躍基因體（推測為SETD2活性所致）。
WGBS顯示，Nsd1敲除2i mES細胞中DNA甲基化水平極低，但主動基因體出現(xiàn)DNA甲基化增加（可能由于DNMT3A重定向）；而在EpiLC分化過程中，Nsd1敲除細胞的DNA甲基化積累顯著延遲，尤其在H3K36me2富集區(qū)域（圖6b-d）。相比之下，從E3.5 ICM到E6.5 Epi的體內發(fā)育中，Nsd1敲除的DNA甲基化缺失相對較輕（圖6e-f），可能與體內Dnmt3a/3b表達水平更高有關（圖6g）。
結論和啟示
本研究系統(tǒng)揭示了H3K36me2在哺乳動物早期胚胎發(fā)育中作為關鍵表觀遺傳標記信號及其動態(tài)重編程規(guī)律，具體而言，H3K36me2通過差異性介導DNMT3A和DNMT3B實現(xiàn)對植入后譜系和位點特異性DNA甲基化重建的精準調控。該發(fā)現(xiàn)不僅深化了對生命起源初期表觀基因組正確編程機制的理解，揭示了DNMT3A與DNMT3B在機制上的根本性差異，也為探索發(fā)育異常、疾病中表觀調控動態(tài)變化提供了新的研究思路。研究所展示的多時間點、微量樣本多組學整合分析策略，為未來研究其他動態(tài)生物學過程中的表觀遺傳機制提供方法學參考。
ChIP-seq和WGBS在本研究中的核心作用
ChIP-seq：克服早期胚胎樣本量極少的挑戰(zhàn)，實現(xiàn)了對H3K36me2、H3K36me3、H3K27ac等多種組蛋白修飾在多個精細發(fā)育時間點的全基因組動態(tài)監(jiān)測，從而繪制出前所未有的H3K36me2重編程全景圖譜。
WGBS：提供DNA甲基化水平的單堿基分辨率檢測，將H3K36me2動態(tài)變化與DNA甲基化建立直接關聯(lián)，并在Nsd1敲除、PRC1缺失等遺傳模型中定量評估甲基化缺失程度與區(qū)域特異性。
ChIP-seq和WGBS兩種技術的整合應用，從“因”（組蛋白修飾）和“果”（DNA甲基化）上嚴謹?shù)仳炞C了H3K36me2的調控功能，并精細解析了其對不同譜系、不同位點的特異性影響，是本研究取得突破性發(fā)現(xiàn)的關鍵技術保障。
參考文獻：Lu X, Wang L, Liu B, Hu X, Wang Z, Liu L, Yu G, Dong L, Kong F, Fan Q, Zhang Y, Xie W. Reprogramming of H3K36me2 guides lineage-specific post-implantation de novo DNA methylation. Nat Cell Biol. 2025 Nov 11. doi: 10.1038/s41556-025-01805-8.
近日，山東大學盧緒坤副研究員、清華大學頡偉教授和復旦大學張宇青年研究員團隊合作，通過全基因組DNA甲基化測序（WGBS）、染色質免疫共沉淀測序（ChIP-seq）和轉錄組測序（Smart-seq）等分析系統(tǒng)揭示了組蛋白修飾H3K36me2在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中的動態(tài)重編程規(guī)律及其對胚胎植入后譜系特異性de novo DNA甲基化中的關鍵調控作用。相關研究成果以“Reprogramming of H3K36me2 guides lineage-specific post-implantation de novo DNA methylation”為題發(fā)表于《Nature Cell Biology 》期刊。
研究通過STAR ChIP-seq和WGBS等高通量測序技術，繪制了從卵母細胞到植入后胚胎的H3K36me2全基因組圖譜，并發(fā)現(xiàn)H3K36me2在合子基因組（ZGA）激活后分兩步重建（de novo）：首先在ZGA后定位于增強子區(qū)域，隨后在植入后擴散至全基因組（除失活X染色體外）。有趣的是，這種重編程通過差異性調控DNMT3A和DNMT3B兩種DNA甲基轉移酶，實現(xiàn)對胚胎譜系（高甲基化）和胚外譜系（部分甲基化）以及特定位點（生殖系基因啟動子）DNA甲基化建立的精準調控。本研究結果為理解哺乳動物表觀遺傳重編程機制提供了重要理論依據(jù)。
英文標題：Reprogramming of H3K36me2 guides lineage-specific post-implantation de novo DNA methylation
中文標題：H3K36me2重編程調控譜系特異性植入后的de novo DNA甲基化
發(fā)表時間：2025年11月11日
發(fā)表期刊：Nature Cell Biology
影響因子：IF19.1/Q1
技術平臺：ChIP-seq、WGBS、Smart-seq2
作者單位：山東大學、清華大學、復旦大學
DOI:10.1038/s41556-025-01805-8
廣泛所知，哺乳動物在受精后會經歷全局DNA去甲基化，隨后在胚胎植入后重建，但其背后分子機制尚未完全闡明。本研究探究了小鼠早期發(fā)育過程中H3K36me2重編程規(guī)律及其在植入后DNA甲基化重建中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在卵母細胞中，H3K36me2伴隨轉錄沉默主要在基因體區(qū)域積累，并部分維持至8細胞期；當合子基因組激活后，H3K36me2在增強子區(qū)域重建，隨后在植入后擴散至全基因組。此外，H3K36me2甲基轉移酶NSD1突變會損害植入后的全局DNA甲基化，尤其在胚外譜系以及易甲基化的啟動子區(qū)域表現(xiàn)顯著。同時，DNA甲基化建立可通過DNMT3B上調且存在部分不依賴于H3K36me2，即沒有H3K36me2/3仍能發(fā)揮一定作用；與之相對的，DNMT3A通過PWWP結構域并嚴格依賴H3K36me2/3才能進行DNA甲基化。最后，研究還發(fā)現(xiàn)DNA甲基化谷（DMVs）通過PRC1/H2AK119ub1介導的H3K36me2排斥機制避免了de novo DNA甲基化。因此，H3K36me2重編程調控了譜系特異性和位點特異性的植入后DNA甲基化建立。
易小結
本研究系統(tǒng)闡明了H3K36me2連接組蛋白修飾與DNA甲基化兩種關鍵表觀遺傳標記的分子機制，填補了植入后DNA甲基化重建調控機制的研究空白，對生殖醫(yī)學、發(fā)育生物學及表觀遺傳疾病機理研究具有重要指導價值。
技術上，本研究充分發(fā)揮WGBS和ChIP-seq協(xié)同優(yōu)勢，構建從染色質狀態(tài)到DNA甲基化的完整調控機制，為解析動態(tài)、微量樣本的表觀遺傳多組學整合策略在揭示復雜生物學過程中的重要作用，為未來探索其他發(fā)育或疾病模型中的表觀調控機制提供可借鑒的研究思路。
研究方法
（1）小鼠模型和樣本處理：
利用C57BL/6N和PWK/PhJ品系小鼠，收集從卵母細胞到胚胎第8.5天（E8.5）的各個發(fā)育階段樣本；分離囊胚的內細胞團（ICM）和滋養(yǎng)層（TE），并獲得植入后胚胎的胚胎外胚層（Epi）和胚外外胚層（ExE）譜系組織；構建催化結構域關鍵位點缺失的Nsd1基因敲除（KO）小鼠。
（2）關鍵分子機制探索：
STAR ChIP-seq：對微量樣本（如卵母細胞、早期胚胎）進行H3K36me2、H3K36me3、H3K27ac、H3K27me3、H2AK119ub1等組蛋白修飾的全基因組定位分析。
全基因組甲基化測序（WGBS）：對胚胎和組織樣本進行全基因組DNA甲基化檢測，以評估不同發(fā)育階段和基因型下的甲基化動態(tài)。
微量RNA-seq（Smart-seq2）：分析基因表達變化，并與表觀修飾數(shù)據(jù)關聯(lián)。
（3）體外實驗：
利用小鼠胚胎干細胞（mESCs），通過基因編輯（CRISPR-Cas9）構建Nsd1敲除、PRC1核心組分（RING1A/B）缺失、以及DNMT3A/3B/TET等多基因敲除的細胞系。在體外模擬從“初始態(tài)”到“形成態(tài)”多能性轉變（2i到EpiLCs），研究DNA甲基化建立過程。
（4）藥理學干預：
使用轉錄抑制劑（α-amanitin, DRB）、細胞周期抑制劑（aphidicolin）、組蛋白乙�；种苿ˋ-485）等處理胚胎，探究轉錄、細胞周期、組蛋白修飾對H3K36me2重編程的作用。
（5）分子生物學與生化實驗：
免疫熒光染色、蛋白質免疫印跡（Western Blot）、過表達DNMT3A/3B及其PWWP結構域缺失突變體等，驗證蛋白表達、定位及功能。
關鍵結果
（1）H3K36me2在小鼠早期發(fā)育過程中動態(tài)重編程及卵母細胞中轉錄依賴性的H3K36me2/3動態(tài)變化
研究團隊首先通過免疫染色和STAR ChIP-seq技術（圖1a）繪制了從卵母細胞到植入后胚胎的H3K36me2全基因組分布圖譜。研究結果發(fā)現(xiàn)，H3K36me2動態(tài)變化與H3K36me3（始終位于活躍基因體）存在顯著差異。在卵母細胞和植入前胚胎中，H3K36me2主要存在于基因體區(qū)域（圖1a藍色陰影），而在ZGA后， H3K36me2開始出現(xiàn)在增強子區(qū)域（圖1a紅色陰影及黑色箭頭），并在植入后擴展至全基因組的基因間區(qū)域（圖1a綠色陰影），類似于小鼠胚胎干細胞（mESCs）和體細胞中的模式。
在卵母細胞成熟過程中，H3K36me2和H3K36me3的分布與轉錄狀態(tài)密切相關。在轉錄活躍的非包繞核仁(non-surrounded nucleolus,NSN)的成熟卵母細胞（full-grown oocyte,FGO)中，H3K36me3高度富集于活躍基因體，而H3K36me2水平較低（圖1b-c）。隨著卵母細胞成熟至轉錄沉默的包繞核仁（SN）FGO和MII期，基因體上的H3K36me2增加，H3K36me3減少（圖1b-c）。使用轉錄抑制劑DRB處理NSN卵母細胞，可以介導活躍基因體上H3K36me2增加和H3K36me3減少（圖1d-e），證實了這種動態(tài)的轉錄依賴性。上述發(fā)現(xiàn)解釋了卵母細胞特異性DNA甲基化模式的建立機制，即H3K36me3主導轉錄活躍區(qū)域的DNA甲基化，而H3K36me2可能在其他區(qū)域發(fā)揮作用。
圖1：小鼠卵母細胞及早期胚胎中H3K36me2的定位圖譜
（2）父源H3K36me2在早期合子中缺失，而母源H3K36me2在植入前發(fā)育中緩慢減少，ZGA后轉錄關聯(lián)的H3K36me2重編程
通過等位基因特異性ChIP-seq分析，研究精確追蹤了雙親本H3K36me2命運（圖2）。結果顯示，父源H3K36me2在受精后的早期合子中幾乎完全缺失（與免疫染色結果一致），隨后逐漸重建。而母源H3K36me2在1-8細胞期胚胎中被短暫繼承，其模式與MII期卵母細胞相似，之后逐漸減弱。因此，在囊胚ICM之前，全基因組范圍的H3K36me2呈現(xiàn)母源偏向。這種雙親本差異導致早期胚胎中H3K36me2存在顯著的母源偏倚，直至ICM階段才實現(xiàn)等位基因平衡。對于卵母細胞特異性基因，母源H3K36me2可維持至8細胞階段，而H3K36me3在MII期即已丟失，提示兩種修飾具有不同的染色質繼承穩(wěn)定性。這一發(fā)現(xiàn)揭示了早期胚胎中表觀遺傳信息的不對稱傳遞模式。
ZGA標志著胚胎從母源調控向合子調控轉換，研究深入分析了此階段H3K36me2的重編程機制。在主要ZGA基因和持家基因（HK）中，ZGA后基因體區(qū)域出現(xiàn)H3K36me2相對缺失，而側翼區(qū)域出現(xiàn)H3K36me2重建（圖2b-c）。使用α-amanitin抑制轉錄可阻止2細胞期和8細胞期胚胎中ZGA基因和持家基因區(qū)域H3K36me2的這種重編程（圖2d-e）。表明ZGA后基因體上的H3K36me2重編程依賴于合子轉錄。
圖2：H3K36me2在小鼠早期發(fā)育過程中發(fā)生動態(tài)重編程。
（3）H3K36me2在ZGA后于推定的增強子區(qū)域重建，H3K36me2在失活X染色體上缺失，并在X染色體再激活后于增強子區(qū)域重現(xiàn)
研究發(fā)現(xiàn)了H3K36me2重編程的關鍵特征。分析發(fā)現(xiàn)，ZGA后H3K36me2與增強子標記H3K27ac的共定位顯著增強，相關性從1細胞期的R=0.28升至8細胞期的R=0.79（圖3a-b）。 遠端H3K27ac峰在8細胞期被H3K36me2優(yōu)先標記（圖3a底部）。使用A-485抑制P300/CBP介導的組蛋白乙�；�，特異性地損害了8細胞期胚胎中H3K27ac富集區(qū)域的H3K36me2重建（圖3c-d），表明組蛋白乙�；糠纸閷3K36me2向增強子招募。但H3K36me2在植入前并未擴散至全基因組，其限制因子尚不完全清楚，可能存在其他調控機制。
在經歷印記X染色體失活（XCI）的胚外譜系中，失活的父源X染色體（Xp）在植入前發(fā)育全階段始終維持極低的H3K36me2水平（圖3e）。在體外來源的胚外內胚層（XEN）細胞中，沉默Xist導致失活X染色體部分再激活，伴隨H3K36me2在Xp上顯著增加，且與H3K27ac獲得和H2AK119ub1/H3K27me3減少密切相關（圖3f）。再激活后出現(xiàn)的H3K36me2峰靠近去抑制基因，提示其與增強子活性和基因激活相關。這一發(fā)現(xiàn)表明XCI狀態(tài)通過PRC1介導的H2AK119ub1和PRC2介導的H3K27me3排斥H3K36me2，維持Xi的表觀遺傳沉默。
圖3：H3K36me2在增強子區(qū)域重建可能由組蛋白乙�；閷�。
（4）H3K36me2與胚外譜系中DNA甲基化建立相關性更強
研究利用已發(fā)表的野生型及Dnmt3a和Dnmt3b敲除胚胎數(shù)據(jù)，分析了H3K36me2/3與植入后DNA甲基化建立的相關性。在胚胎譜系(Epi)中中，野生型胚胎從ICM到E6.5的DNA甲基化增益與H3K36me3相關性較弱（R=0.08），與H3K36me2相關性中等（R=0.33）。Dnmt3b敲除后，DNMT3A依賴的DNA甲基化與H3K36me2/3的相關性顯著增強（H3K36me2: R=0.50；H3K36me3: R=0.38），而Dnmt3a敲除后DNMT3B依賴的DNA甲基化與H3K36me2/3相關性仍較低（圖4c-d）。相比之下，在胚外譜系（ExE）中，無論是野生型還是僅存在一種DNMT的情況下，DNA甲基化增益與H3K36me2/3相關性都更強（圖4c,f-g）。進一步分析顯示，DNMT3A和DNMT3B主要甲基化H3K36me2/3標記區(qū)域，而H3K36me2/3低的區(qū)域則更多地依賴于DNMT3B（圖4e）。這表明胚外譜系更依賴H3K36me2/3指導的DNA甲基化建立，可能與該譜系中Dnmt3a/3b表達水平較低有關。
（5）H3K36me2調控體內植入后DNA甲基化建立，H3K36me2促進包括生殖系基因在內的啟動子區(qū)域甲基化
通過建立Nsd1催化失活突變小鼠模型，研究直接驗證了H3K36me2在體內的功能。Nsd1敲除導致胚胎從E6.5起出現(xiàn)嚴重生長遲緩，E8.5前致死（圖5a-b）。H3K36me2在E6.5胚胎中整體丟失，主要影響非轉錄區(qū)域（圖5c）。WGBS分析顯示，突變體胚胎中H3K36me2富集區(qū)域的DNA甲基化在胚胎譜系中中度下降，但在胚外譜系中缺失顯著（圖5c-d）。而H3K36me3富集區(qū)域的DNA甲基化幾乎不受影響，提示DNMT3A/3B在H3K36me2缺失時被重定向至H3K36me3標記區(qū)域。DNA甲基化缺失趨勢從E6.5到E8.5在胚胎譜系中逐漸減小，但在胚外譜系中加�。▓D5d），與兩種譜系中Dnmt3b表達差異相一致。上述研究結果表明在胚外譜系中，H3K36me2對植入后DNA甲基化建立至關重要。
研究者關注了一類對DNA甲基化敏感的生殖系基因（DMS germline genes）。WGBS分析顯示，在E6.5胚胎譜系中，Nsd1敲除導致這些基因的CpG島和非CpG島啟動子甲基化降低，在胚外譜系中也觀察到類似的啟動子低甲基化和部分基因去抑制（圖5e）。RNA-seq(Smart-seq2)分析發(fā)現(xiàn)Nsd1敲除的E6.5 Epi中有1158個基因上調、737個下調，上調基因顯著富集于減數(shù)分裂細胞周期和piRNA代謝通路，包括Piwil2、Ddx4、Asz1、Sohlh2、Sycp1等生殖系特異性基因；其中67個（48.9%）DMS生殖系基因上調表達，如Sohlh2和Tex19.1（圖5f-g）。這種啟動子低甲基化和基因去抑制狀態(tài)持續(xù)至E8.5。值得注意的是，在野生型胚胎中，DMS生殖系基因啟動子上的H3K36me2水平高于所有啟動子的平均水平。表明H3K36me2促進了植入后胚胎中啟動子（包括生殖系基因啟動子）甲基化維持生殖系基因的沉默狀態(tài)，防止其過早表達。
（6）H3K36me2調控體外“初始態(tài)”向“形成態(tài)”多能性轉變過程中的高效de novo DNA甲基化
研究利用2i mES細胞向EpiLCs分化的體外模型模擬“初始態(tài)”（naive）向“形成態(tài)”（formative）轉變（2i mESCs向EpiLCs分化）。結果顯示，Nsd1敲除在2i mES細胞中導致H3K36me2幾乎完全缺失，剩余信號僅存在于H3K36me3富集的活躍基因體（推測為SETD2活性所致）。
WGBS顯示，Nsd1敲除2i mES細胞中DNA甲基化水平極低，但主動基因體出現(xiàn)DNA甲基化增加（可能由于DNMT3A重定向）；而在EpiLC分化過程中，Nsd1敲除細胞的DNA甲基化積累顯著延遲，尤其在H3K36me2富集區(qū)域（圖6b-d）。相比之下，從E3.5 ICM到E6.5 Epi的體內發(fā)育中，Nsd1敲除的DNA甲基化缺失相對較輕（圖6e-f），可能與體內Dnmt3a/3b表達水平更高有關（圖6g）。
圖6：H3K36me2在體外調控de novo DNA甲基化。
結論和啟示
本研究系統(tǒng)揭示了H3K36me2在哺乳動物早期胚胎發(fā)育中作為關鍵表觀遺傳標記信號及其動態(tài)重編程規(guī)律，具體而言，H3K36me2通過差異性介導DNMT3A和DNMT3B實現(xiàn)對植入后譜系和位點特異性DNA甲基化重建的精準調控。該發(fā)現(xiàn)不僅深化了對生命起源初期表觀基因組正確編程機制的理解，揭示了DNMT3A與DNMT3B在機制上的根本性差異，也為探索發(fā)育異常、疾病中表觀調控動態(tài)變化提供了新的研究思路。研究所展示的多時間點、微量樣本多組學整合分析策略，為未來研究其他動態(tài)生物學過程中的表觀遺傳機制提供方法學參考。
ChIP-seq和WGBS在本研究中的核心作用
ChIP-seq：克服早期胚胎樣本量極少的挑戰(zhàn)，實現(xiàn)了對H3K36me2、H3K36me3、H3K27ac等多種組蛋白修飾在多個精細發(fā)育時間點的全基因組動態(tài)監(jiān)測，從而繪制出前所未有的H3K36me2重編程全景圖譜。
WGBS：提供DNA甲基化水平的單堿基分辨率檢測，將H3K36me2動態(tài)變化與DNA甲基化建立直接關聯(lián)，并在Nsd1敲除、PRC1缺失等遺傳模型中定量評估甲基化缺失程度與區(qū)域特異性。
ChIP-seq和WGBS兩種技術的整合應用，從“因”（組蛋白修飾）和“果”（DNA甲基化）上嚴謹?shù)仳炞C了H3K36me2的調控功能，并精細解析了其對不同譜系、不同位點的特異性影響，是本研究取得突破性發(fā)現(xiàn)的關鍵技術保障。
參考文獻：Lu X, Wang L, Liu B, Hu X, Wang Z, Liu L, Yu G, Dong L, Kong F, Fan Q, Zhang Y, Xie W. Reprogramming of H3K36me2 guides lineage-specific post-implantation de novo DNA methylation. Nat Cell Biol. 2025 Nov 11. doi: 10.1038/s41556-025-01805-8.
