抗體-寡核苷酸偶聯(lián)物(AOC)的制備方法及在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的多種應(yīng)用

本文來源于微信公眾： 研學(xué)Biotech   作者： GENTOP

在生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)研究飛速發(fā)展的今天，科學(xué)家們不斷嘗試將不同功能的生物分子“強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合”，創(chuàng)造出性能更優(yōu)的新型工具。其中，抗體-寡核苷酸偶聯(lián)物（AOC）正逐漸成為一顆耀眼的新星，在疾病治療、高精度成像和超靈敏檢測等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力。

什么是抗體-寡核苷酸偶聯(lián)物？
抗體-寡核苷酸偶聯(lián)物，簡稱AOC，是一類將抗體與寡核苷酸通過化學(xué)或生物方法連接而成的嵌合生物分子。

抗體：被譽(yù)為“生物導(dǎo)彈”，能精準(zhǔn)識別并結(jié)合特定抗原，廣泛應(yīng)用于靶向治療和免疫檢測。

寡核苷酸：短鏈的DNA或RNA分子，不僅承載遺傳信息，還能用于基因調(diào)控、信號放大、自組裝納米結(jié)構(gòu)等。

將二者的優(yōu)勢結(jié)合，AOC既能實現(xiàn)抗體的精準(zhǔn)靶向，又能發(fā)揮寡核苷酸的多樣化功能，可謂“一箭雙雕”。

抗體的高親和力（解離常數(shù)處于亞納摩爾范圍）以及寡核苷酸（ON）功能基團(tuán)的多樣性。正是這種功能多樣性使得這些構(gòu)建體能夠觸發(fā)從免疫應(yīng)答到細(xì)胞分化、凋亡及蛋白質(zhì)表達(dá)等復(fù)雜生物學(xué)機(jī)制。

AOC的一個重要特征是偶聯(lián)度（DoC），它代表每個抗體上的ON分子數(shù)量。平均DoC值可通過質(zhì)譜分析或凝膠電泳獲得。DoC值直接決定了AOC的分子量和大小，因此影響諸如溶解性、親和力和聚集性等理化性質(zhì)。此外，ON分子顯著的負(fù)電荷對抗體有重要影響，而抗體在中性pH下帶正電。因此，偶聯(lián)物的整體電荷與DoC值成正比。通常是具有不同DoC的組分復(fù)雜混合物。如圖1所示。

圖1. (a) AOC的簡化示意圖，(b) 平均DoC為1的賴氨酸偶聯(lián)型AOC中不同DoC值組分的典型分布。

AOC的三大核心應(yīng)用領(lǐng)域
檢測、成像、治療
1. 超高靈敏度檢測
傳統(tǒng)的蛋白檢測方法（如ELISA）靈敏度有限。AOC的出現(xiàn)帶來了革命性突破。
免疫-PCR：將DNA標(biāo)簽連接在抗體上，通過PCR擴(kuò)增DNA信號，檢測靈敏度提升高達(dá)10萬倍！如圖2所示。

圖2.（a−c）: 不同免疫PCR方案，d: ELISA 技術(shù)的示意圖; (a)順序法（先加入一抗，再加入蛋白A/G−DNA偶聯(lián)物）；(b)模塊化法（先加入一抗，再加入二抗−DNA偶聯(lián)物）；(c)直接免疫PCR法（加入AOC）

2. 鄰近連接/延伸檢測
使用一對AOC探針，只有當(dāng)它們結(jié)合到相鄰目標(biāo)時，其連接的DNA片段才能連接或延伸，并被擴(kuò)增檢測，適用于研究蛋白質(zhì)相互作用或翻譯后修飾。

鄰近連接分析（PLA）是通過巧妙結(jié)合兩種現(xiàn)有技術(shù)——酶促DNA連接與PCR擴(kuò)增而實現(xiàn)的。該檢測方法采用一對具有不同蛋白表位親和力的寡核苷酸（用于檢測），或針對不同蛋白的寡核苷酸（用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究）。PLA探針的寡核苷酸片段設(shè)計為與后續(xù)添加的連接寡核苷酸互補(bǔ)。當(dāng)探針被置于緊密鄰近位置（即目標(biāo)蛋白彼此靠近或構(gòu)成蛋白質(zhì)復(fù)合體時），通過添加DNA連接酶即可實現(xiàn)兩端連接。連接產(chǎn)物隨后可通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，而未反應(yīng)的探針則保持沉默狀態(tài)。如圖3所示。

圖3. (a) PLA與(b) PEA探針用于蛋白質(zhì)檢測的作用模式

為解決鄰近連接分析在復(fù)雜生物液體中回收率低、效率有限的問題，F(xiàn)redriksson課題組開發(fā)了基于DNA聚合酶的鄰近延伸分析技術(shù)。該技術(shù)最初利用兩個AOC探針在靶標(biāo)介導(dǎo)下使互補(bǔ)DNA片段雜交，再經(jīng)聚合酶延伸形成可qPCR檢測的擴(kuò)增子；后續(xù)改進(jìn)為直接使用單鏈互補(bǔ)寡核苷酸，并引入超嗜熱聚合酶及多靶標(biāo)檢測中的引物消化步驟，近期還與單細(xì)胞RNA擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)用。為克服此類酶依賴方法成本高、操作繁瑣的缺點，研究者進(jìn)一步將AOC鄰近結(jié)合與雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合，發(fā)展出無酶擴(kuò)增版本，該策略也被用于提升細(xì)胞因子分泌細(xì)胞的檢測靈敏度。

3. 電化學(xué)鄰近檢測
利用AOC結(jié)合目標(biāo)后引起電極表面電化學(xué)信號變化，實現(xiàn)無需擴(kuò)增的超靈敏檢測。

圖4a. 蛋白質(zhì)檢測 ECPA 的作用機(jī)制

4. 超分辨率成像
DNA-PAINT技術(shù)利用AOC將成像DNA鏈“停泊”在目標(biāo)蛋白附近，通過熒光DNA鏈的瞬時結(jié)合與解離，實現(xiàn)納米級分辨率的細(xì)胞成像，可同時觀察多個靶標(biāo)。

圖4b. DNA-paint用于靶標(biāo)成像的作用機(jī)制

5. 靶向治療與藥物遞送
AOC在治療領(lǐng)域主要發(fā)揮兩種作用：
靶向遞送治療性核酸：利用抗體將siRNA或反義寡核苷酸精準(zhǔn)送至病變細(xì)胞，用于治療癌癥、病毒感染等。
預(yù)靶向放射治療：先注射靶向癌細(xì)胞的AOC，再注射攜帶放射性核素的互補(bǔ)DNA鏈，在腫瘤處原位結(jié)合，提高療效并減少副作用。

圖5. AOC在(a)抗體陣列；(b)治療性應(yīng)用；及(c)預(yù)靶向應(yīng)用中的示意圖

如何制備AOC？關(guān)鍵技術(shù)與挑戰(zhàn)
制備AOC的方法主要分為非共價連接和共價連接兩大類。

非共價方法
鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)：經(jīng)典可靠，但容易形成混合產(chǎn)物。
Protein A/G系統(tǒng)：通過抗體Fc段結(jié)合，再與DNA連接，適用于芯片和成像。

圖6. 基于非共價相互作用對的不同AOC制備方案：(a)共價連接的ON-鏈霉親和素偶聯(lián)物與生物素化抗體；(b)鏈霉親和素與兩個生物素化生物分子的連接；(c)蛋白G/Fc連接；(d)SNAP標(biāo)簽-BG對；(e)鄰近驅(qū)動的紫外激活共價AOC制備

共價方法
這是目前主流研究方向，追求位點特異性和均一性：
經(jīng)典賴氨酸：使用異雙功能交聯(lián)劑（如SMCC），方法通用但產(chǎn)物不均一。

圖7. 采用胺-硫醇偶聯(lián)法制備AOC

該抗體通過與含有活化酯基和馬來酰亞胺殘基的交聯(lián)劑反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為馬來酰亞胺修飾底物（參見圖8中的通用方案）。隨后將兩種反應(yīng)物純化、混合，并通過提高反應(yīng)緩沖液的pH值來啟動它們之間的反應(yīng)。通常采用凝膠過濾法對所得產(chǎn)物進(jìn)行純化。

圖8. 氨基-硫醇偶聯(lián)通用方案

采用可光解的雙功能馬來酰亞胺-NHS交聯(lián)劑，制備可光解DNA條形碼-抗體偶聯(lián)物，用于提高單個活細(xì)胞中蛋白質(zhì)的檢測靈敏度（圖9）。該修飾使得DNA條形碼可通過光解釋放，從而在靶標(biāo)結(jié)合后實現(xiàn)其分離、擴(kuò)增和讀取。

圖9. 通過光解連接子偶聯(lián)的DNA條形碼AOCs及其在蛋白質(zhì)檢測中的應(yīng)用

SATA試劑常用于在蛋白質(zhì)賴氨酸殘基上引入保護(hù)性硫醇基團(tuán)。隨后可使用羥胺輕松脫保護(hù)。該方法適用于單克隆抗體的潛在硫醇化修飾。具體步驟：首先用SATA修飾抗體以引入保護(hù)性硫醇?xì)埢�；接著�?SMCC 修飾DNA片段，生成含馬來酰亞胺的DNA；最后通過向SATA修飾的抗體中加入羥胺（生成游離硫醇基團(tuán)）并加入活化的DNA-馬來酰亞胺片段，啟動偶聯(lián)反應(yīng)。（圖10所示）

圖10. 使用SATA試劑對抗體進(jìn)行硫醇化處理

腙偶聯(lián)：抗體首先與琥珀酰亞胺基4-羥基煙酰胺酮丙酮肼（SHyNic）反應(yīng)，以在抗體中引入親核性肼基團(tuán)（圖11所示）。

圖11. AOC制備的腙偶聯(lián)技術(shù)

DNA模板引導(dǎo)的蛋白質(zhì)偶聯(lián)：利用DNA雜交將反應(yīng)基團(tuán)引導(dǎo)至抗體特定區(qū)域，實現(xiàn)位點選擇性標(biāo)記。

通過三氨基修飾DNA制備含有三個亞硝基三乙酸（NTA）的導(dǎo)向性O(shè)N。隨后，通過用二NHS連接體修飾互補(bǔ)ON，生成反應(yīng)性O(shè)N，形成ON-NHS。如圖12所示。

圖12. DTPC 方案

當(dāng)抗體與導(dǎo)向性O(shè)N孵育時，銅（II）介導(dǎo)的螯合作用會在ON的NTA手柄與抗體金屬結(jié)合口袋中的組氨酸簇之間發(fā)生，從而形成非共價AOC結(jié)構(gòu)（圖13右所示）。隨后加入互補(bǔ)反應(yīng)性O(shè)N，使NHS活化酯與賴氨酸殘基的可用游離氨基緊密接觸，生成相應(yīng)的共價加合物。將水解不穩(wěn)定的活化酯替換為反應(yīng)性O(shè)N上的醛基，以實現(xiàn)抗體近端賴氨酸殘基的還原胺化。該方法被應(yīng)用于開發(fā)一種通用策略，通過高碘酸鹽裂解反應(yīng)性O(shè)N中含有的1,2-二醇連接體，將醛基手柄引入去糖基化抗體（圖13左所示）。

圖13. 利用天然抗體的金屬結(jié)合位點進(jìn)行DNA模板介導(dǎo)的近端賴氨酸偶聯(lián)，用于抗體中AOC生成（右）或醛基引入（左）

半胱氨酸殘基偶聯(lián)：通過基因工程將額外的保護(hù)性半胱氨酸殘基整合到抗體結(jié)構(gòu)中（硫醇化單抗技術(shù)）。這類抗體可用于將單抗與通過 SMCC 或 SPDB 交聯(lián)劑獲得的巰基反應(yīng)性寡核苷酸（ON）連接，但需先進(jìn)行初步去保護(hù)步驟，將保護(hù)性半胱氨酸殘基轉(zhuǎn)化為游離巰基（圖14a所示）。另外通過部分還原抗體鏈間二硫鍵可生成游離巰基（圖14b所示；參見圖15中的方案）。

圖14. 使用(a)工程化單克隆抗體或(b)鏈間二硫鍵還原法制備半胱氨酸連接的AOC

圖15. 部分還原抗體偶聯(lián)方案

點擊化學(xué)：如應(yīng)變促進(jìn)的炔-疊氮環(huán)加成，反應(yīng)高效、生物相容性好。

抗體可通過含疊氮基的異功能連接體進(jìn)行修飾，以便與標(biāo)記有張力炔烴的ONs進(jìn)一步反應(yīng)（圖16中的方案）。另一種‘即插即用’的天然抗體功能化方法，采用4-疊氮苯甲酰氟（ABF ，圖17所示）。ABF 試劑在抗體反應(yīng)中表現(xiàn)出顯著快于類似NHS活化酯的動力學(xué)特性，這使得在4℃和25℃條件下均能實現(xiàn)更高的偶聯(lián)效率。因此， ABF 試劑的應(yīng)用對于需要快速高效偶聯(lián)敏感生物分子的場景具有顯著優(yōu)勢。這種“即插即用”的策略進(jìn)一步拓展至使用4-疊氮苯基乙二醛（APG）試劑對抗體進(jìn)行精氨酸選擇性功能化， 由于天然抗體中精氨酸含量低于賴氨酸，精氨酸選擇性偶聯(lián)技術(shù)在制備均一化抗體偶聯(lián)物（AOCs）方面尤為突出。具體而言，與賴氨酸偶聯(lián)（使用活化酯試劑可修飾約40-60個賴氨酸殘基）不同，在相同反應(yīng)條件下使用APG試劑僅需修飾3-8個不同的精氨酸殘基。

圖16. 插入式偶聯(lián)方案

圖17. 使用天然抗體賴氨酸或精氨酸殘基制備的疊氮化物標(biāo)記抗體的 SPAAC 功能化

狄爾斯-阿爾德反應(yīng)（iEDDA）：制備含有二硫鍵可裂解連接子和反式環(huán)辛烯（TCO）修飾DNA標(biāo)簽的四嗪修飾抗體（圖18a所示）。經(jīng)細(xì)胞孵育和充分洗滌后，通過還原抗體與DNA組分間的二硫鍵連接子，可對結(jié)合于細(xì)胞表面的AOCs的DNA標(biāo)簽進(jìn)行測序。

圖18a. iEDDA反應(yīng)在AOC生成中的應(yīng)用

非天然氨基酸插入：通過基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)，在抗體特定位點引入酮基等反應(yīng)基團(tuán)，實現(xiàn)高度均一的偶聯(lián)。

例如，含酮基的非天然氨基酸（如乙�；�-L-苯丙氨酸（pAcF））可通過基因整合方式引入。利用針對pAcF的進(jìn)化型正交tRNA/氨酰tRNA合成酶對，響應(yīng)琥珀 UAG 密碼子在抗體特定位點進(jìn)行修飾。隨后，pAcF的酮基可在溫和反應(yīng)條件下形成穩(wěn)定的肟鍵，選擇性地與氨基氧基衍生配體偶聯(lián)，類似于化學(xué)Hydralink方法（圖18b；參見圖19中的方案）。

圖18b. 肟鍵合在AOC生成中的應(yīng)用

圖19 肟鍵合偶聯(lián)方案

當(dāng)前挑戰(zhàn)：如何在保持抗體活性的前提下，實現(xiàn)高產(chǎn)率、高均一性、高穩(wěn)定性的偶聯(lián)，仍是科研與產(chǎn)業(yè)化的核心課題。

未來展望
隨著蛋白質(zhì)工程、合成化學(xué)和納米技術(shù)的進(jìn)步，AOC的制備技術(shù)將更加精準(zhǔn)、高效。其在液體活檢、單細(xì)胞分析、多靶點成像、細(xì)胞療法等前沿領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。未來，我們有望看到更多基于AOC的臨床診斷試劑和靶向藥物問世，真正實現(xiàn)“從實驗室到臨床”的轉(zhuǎn)化。

AOC不僅代表了生物共軛化學(xué)的前沿，更是交叉學(xué)科創(chuàng)新的典范——它融合了免疫學(xué)、核酸化學(xué)、材料科學(xué)與工程學(xué)，為我們理解生命過程和戰(zhàn)勝疾病提供了全新的武器。