MeRIP-seq揭示m6A甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控炎癥性肺病機制

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2026年1月22日，廣東醫(yī)科大學(xué)羅舒華博士和張茜茜碩士為共同第一作者、唐靖教授等為通訊作者，在TOP期刊《Journal of Advanced Research》發(fā)表題為“METTL3 promotes neutrophil extracellular trap formation via SYK/ERK/MEK signaling during acute lung injury”的研究論文，揭示了m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3在急性肺損傷（ALI）中調(diào)控中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）形成的新機制。研究通過MeRIP-seq等分析發(fā)現(xiàn)在肺部炎癥中，METTL3通過介導(dǎo)SYK mRNA的m6A修飾，增強其穩(wěn)定性及蛋白表達，從而激活下游SYK/ERK/MEK信號軸，驅(qū)動中性粒細胞的NETosis（胞外誘捕網(wǎng)形成過程）。遺傳學(xué)（條件性敲除小鼠）和藥理學(xué)（抑制劑STM2457和R406）干預(yù)均證實，靶向METTL3或SYK可有效抑制NETs形成、減輕肺部炎癥和血管損傷。該研究首次建立METTL3-m6A-SYK表觀轉(zhuǎn)錄調(diào)控軸與NETs驅(qū)動的ALI之間的因果關(guān)聯(lián)，為治療炎癥性肺病提供了新的潛在靶點。
 
英文標題：METTL3 promotes neutrophil extracellular trap formation via SYK/ERK/MEK signaling during acute lung injury
中文標題：METTL3通過SYK/ERK/MEK信號通路促進急性肺損傷中的中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)形成
發(fā)表時間：2026年1月22日
發(fā)表期刊：Journal of Advanced Research
影響因子：IF13/Q1
技術(shù)平臺：MeRIP-seq
作者單位：廣東醫(yī)科大學(xué)、中山大學(xué)
DOI:10.1016/j.jare.2026.01.044
 
本研究旨在探討METTL3介導(dǎo)的m6A修飾對NETs形成的作用及其在ALI肺損傷中的潛在機制。研究團隊通過條件性敲除髓系或中性粒細胞譜系中的METTL3，探究其在ALI中的作用。采用組織學(xué)和流式細胞術(shù)分析、基因干擾、過表達、MeRIP-seq和m6A-RIP-qPCR等方法，在體內(nèi)外闡明METTL3通過SYK/ERK/MEK信號軸促進NETosis的具體機制。

研究結(jié)果顯示在髓系或中性粒細胞譜系中條件性敲除METTL3，可顯著降低脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的ALI后肺組織髓過氧化物酶（MPO）活性、瓜氨酸化組蛋白H3水平和細胞外DNA沉積。METTL3敲除可減輕肺部炎癥并減少中性粒細胞浸潤。體外實驗顯示，METTL3敲除的中性粒細胞在佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）刺激下表現(xiàn)出NETs形成減少，同時SYK磷酸化及其下游ERK/MEK活性降低。此外，機制研究表明，METTL3促進SYK mRNA的m6A甲基化，增強其穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄。METTL3或SYK的藥理學(xué)抑制均可重現(xiàn)保護性表型，在體內(nèi)抑制NETosis和肺損傷。
總之，本研究揭示了一個全新的METTL3-SYK表觀轉(zhuǎn)錄組調(diào)控軸，對內(nèi)毒素誘導(dǎo)肺損傷過程中的中性粒細胞效應(yīng)反應(yīng)進行調(diào)控。以上結(jié)果提示m6A依賴的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控可作為ALI和膿毒癥相關(guān)炎癥的潛在治療靶點。
  圖形摘要：METTL3介導(dǎo)的m6A修飾在促進SYK表達、NETosis和中性粒細胞驅(qū)動的肺損傷中的作用。METTL3的藥理學(xué)抑制可抑制該軸，減輕ALI和膿毒癥中的炎癥和血管損傷。
 
易小結(jié)
本研究將RNA m6A修飾這一動態(tài)可逆的表觀遺傳調(diào)控機制與中性粒細胞效應(yīng)功能直接關(guān)聯(lián)，開辟了“代謝-表觀遺傳-免疫效應(yīng)”三位一體的研究新思路，不僅具有重大科學(xué)創(chuàng)新價值，更展現(xiàn)出向臨床轉(zhuǎn)化的廣闊前景。

研究創(chuàng)新性地應(yīng)用MeRIP-seq技術(shù)對中性粒細胞全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)m6A修飾進行測序分析，為解析免疫細胞功能調(diào)控的表觀轉(zhuǎn)錄組機制提供了可復(fù)制的技術(shù)路線，未來可拓展至其他免疫細胞類型及炎癥性疾病的研究中，具有重要的方法學(xué)參考。

研究方法
（1）模型構(gòu)建

• 髓系特異性（Lyzm-Cre）和中性粒細胞特異性（Ly6G-Cre）的條件性METTL3敲除小鼠（M3cKO）。
• 使用脂多糖（LPS）氣管內(nèi)滴注誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷（ALI）模型。
• 使用盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）手術(shù)構(gòu)建膿毒癥模型。
• 從小鼠骨髓或肺組織中分離原代中性粒細胞。
• 使用人早幼粒白血病細胞HL-60，經(jīng)DMSO誘導(dǎo)分化為中性粒細胞樣細胞（dHL-60）進行體外研究。

（2）表型與功能分析

• 流式細胞術(shù)：分析中性粒細胞（Ly6G+CD11b+）浸潤、SYK及TLR2蛋白表達水平。
• 組織病理學(xué)：H&E染色評估肺損傷評分。
• NETs檢測： 免疫熒光顯微鏡（Sytox Green/DAPI/H3Cit染色）可視化NETs；ELISA檢測血漿MPO-DNA復(fù)合物；Western Blot檢測瓜氨酸化組蛋白H3（H3Cit）。
• 血管通透性：伊文思藍染料滲出實驗。
• 酶活性與產(chǎn)物：髓過氧化物酶（MPO）活性檢測、活性氧（ROS）檢測。
• 吞噬功能：熒光微球吞噬實驗。

（3）機制研究和驗證：

• MeRIP-seq（m6A-seq）：對野生型和METTL3敲除中性粒細胞的總RNA進行m6A測序，在全基因組范圍鑒定差異m6A修飾峰及潛在靶基因。發(fā)現(xiàn)SYK為關(guān)鍵靶點。
• MeRIP-qPCR：對MeRIP-seq篩選出的候選靶點（如SYK、TLR2）進行驗證，定量特定轉(zhuǎn)錄本上的m6A富集程度。
• RNA穩(wěn)定性實驗：使用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D處理細胞，通過qPCR追蹤SYK mRNA的衰減速率，驗證m6A修飾對其穩(wěn)定性的影響。
• 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒?構(gòu)建包含SYK mRNA野生型或m6A位點突變型3'UTR的報告基因載體，驗證m6A修飾對其報告基因活性的影響。
• Western Blot：檢測METTL3、SYK及其磷酸化形式、ERK/MEK及其磷酸化形式、H3Cit等關(guān)鍵蛋白表達。
• Dot Blot：檢測全RNA m6A修飾整體水平。
• qPCR：檢測基因轉(zhuǎn)錄水平。

研究結(jié)果
（1）METTL3敲除可減輕急性肺損傷（ALI）中的中性粒細胞募集和肺損傷
研究團隊首先通過體內(nèi)實驗確立了METTL3在ALI病理中的關(guān)鍵作用。研究人員構(gòu)建了中性粒細胞特異性METTL3敲除（M3cKO）小鼠，并給予LPS誘導(dǎo)ALI。結(jié)果顯示，與野生型（WT）小鼠相比，M3cKO小鼠肺組織和支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的中性粒細胞浸潤顯著減少（圖1B-D）。

組織病理學(xué)H&E染色表明，M3cKO小鼠肺部炎癥、水腫和肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯減輕，肺損傷評分下降（圖1F-G）。此外，M3cKO小鼠肺血管通透性顯著降低（圖1E），提示內(nèi)皮屏障損傷減輕。與NETs形成相關(guān)的標志物也同步下降：肺組織MPO活性降低（圖1H），瓜氨酸化組蛋白H3（H3Cit）水平減少（圖1J）。上述數(shù)據(jù)綜合表明，METTL3是LPS誘導(dǎo)的ALI中中性粒細胞募集、激活和相關(guān)肺損傷所必需的。
   
（2）中性粒細胞METTL3在體外促進NETs形成
隨后，研究人員將表型研究深入至細胞水平，并建立m6A修飾與NETosis的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠或PMA刺激的骨髓源性中性粒細胞（BMNeu）中，整體m6A RNA修飾水平以及METTL3蛋白表達均上調(diào)（圖2C-E）。在體外，使用METTL3抑制劑STM2457處理分化后的HL-60細胞，或直接使用M3cKO小鼠的原代BMNeu，結(jié)果顯示經(jīng)PMA刺激后，NETs形成被顯著抑制（圖2F-I）。同時，NETosis的下游事件，如MPO活性、ROS產(chǎn)生和H3Cit水平，在METTL3敲除細胞中也均減弱（圖2J-M）。

上述研究結(jié)果直接證明METTL3對中性粒細胞NETosis程序具有正向調(diào)控作用。
 
（3）METTL3通過SYK/ERK/MEK信號軸促進NETosis
接下來研究團隊進行核心的分子機制探索。首先，Dot blot分析證實，METTL3敲除導(dǎo)致中性粒細胞中m6A修飾減少（圖3A）。為闡明METTL3如何調(diào)控NETosis，研究團隊進行了MeRIP-seq分析。差異m6A peaks富集分析揭示了ERK/MAPK通路和ROS產(chǎn)生的顯著變化，這兩者是NETs形成的關(guān)鍵（圖3B）。維恩圖富集分析鑒定出SYK、TLR4和Ptk2b三個候選基因（圖3C）。

qPCR證實，只有SYK（一種非受體酪氨酸激酶，中性粒細胞激活所必需）在METTL3敲除（M3cKO）中性粒細胞中顯著下調(diào)（圖3D）。SYK mRNA和蛋白表達在METTL3 cKO BMNeu和METTL3敲低dHL-60中在基礎(chǔ)水平和PMA處理后均顯著降低（圖3E-G）。

為確認SYK在NETosis中的重要性，研究團隊用SYK磷酸化抑制劑R406預(yù)處理BMNeu和dHL-60。該處理顯著減少原代骨髓中性粒細胞和dHL-60細胞中的NETs形成，表現(xiàn)為SYTOX染色減少和H3Cit水平降低。此外與對照組相比，NETosis過程中METTL3敲除（M3cKO）中性粒細胞和METTL3敲低dHL-60中的ERK/MEK活性顯著降低（圖3F）。重要的是，在siMETTL3 dHL-60細胞中過表達SYK增加了PMA誘導(dǎo)的SYK磷酸化水平（圖3H），并恢復(fù)PMA刺激后的NETs形成（圖3I-J）。

上述分析數(shù)據(jù)證實SYK是METTL3的直接m6A靶點，并通過SYK/ERK/MEK信號軸調(diào)控NETosis。
   
（4）METTL3依賴的SYK表達加劇膿毒癥誘導(dǎo)的肺損傷
研究團隊在更復(fù)雜的膿毒癥（CLP）模型和體內(nèi)挽救實驗中驗證了上述軸線的病理相關(guān)性。在LPS或CLP誘導(dǎo)的損傷中，M3cKO小鼠肺部浸潤中性粒細胞的SYK表達低于WT小鼠（圖4A-B）。關(guān)鍵的挽救實驗顯示，通過慢病毒在M3cKO小鼠體內(nèi)過表達SYK，可逆轉(zhuǎn)其保護效應(yīng)，導(dǎo)致肺損傷加重、H3Cit水平回升（圖4C-G）。反之，藥理學(xué)抑制SYK（R406）則可減輕WT小鼠的ALI，降低肺損傷評分、血管滲漏、MPO活性和H3Cit水平（圖4H-K）。研究還發(fā)現(xiàn)METTL3可能通過SYK間接調(diào)控TLR2表達（圖4L-P）。上述體內(nèi)實驗的結(jié)果強有力地表明，METTL3-SYK軸是膿毒癥相關(guān)ALI的重要促進因子。
   
（5）METTL3通過m6A修飾穩(wěn)定SYK mRNA
為進一步研究METTL3調(diào)控SYK表達的分子機制，研究團隊使用MeRIP-seq分析了SYK轉(zhuǎn)錄本上的m6A修飾。在WT中性粒細胞中鑒定到SYK mRNA 3'UTR中的顯著m6A peaks，在METTL3敲除細胞中顯著降低（圖5A）。MeRIP-qPCR證實SYK轉(zhuǎn)錄本在WT細胞中先甲基化（圖5B）。
定量PCR顯示，PMA刺激后METTL3敲除中性粒細胞中SYK mRNA水平較低（圖5C）。為區(qū)分轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，研究團隊進行了放線菌D追蹤實驗。SYK mRNA在METTL3敲除細胞中降解更快，表明METTL3延長了SYK轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性（圖5D-E）。相比之下，新生RNA標記顯示SYK轉(zhuǎn)錄僅適度降低（圖5F）。

使用野生型或突變型SYK 3'UTR的熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鳎琺6A位點缺失顯著降低了報告基因活性（圖5G）。這些數(shù)據(jù)共同證明，METTL3介導(dǎo)的m6A修飾穩(wěn)定了SYK mRNA，支持NETs形成所需的持續(xù)蛋白表達和下游信號。
   
（6）藥理學(xué)抑制METTL3可抑制NETosis并改善肺部預(yù)后
為評估靶向METTL3的治療潛力，研究團隊在LPS誘導(dǎo)ALI前用METTL3抑制劑STM2457預(yù)處理WT小鼠。STM2457處理顯著降低了肺組織和分選血液中性粒細胞中的m6A水平（圖6A）。流式細胞術(shù)檢測顯示，STM2457處理小鼠肺組織中性粒細胞積累顯著減少（圖6B-C）。組織學(xué)分析顯示STM2457處理小鼠肺形態(tài)改善，肺泡塌陷和炎癥浸潤減少（圖6D-E）。Evans藍染料定量的肺血管滲漏也顯著降低（圖6F）。流式細胞術(shù)顯示STM2457降低了肺組織中SYK表達水平和SYK陽性中性粒細胞百分比（圖6G-I）。生化分析證實處理后肺組織中MPO活性和H3Cit表達降低（圖6J-K），提示抑制METTL3破壞了ALI中NETosis和炎癥涉及的關(guān)鍵信號通路。
上述研究結(jié)果證明，METTL3的藥理學(xué)抑制減弱了NETs形成、中性粒細胞激活和肺損傷，具有治療ALI和膿毒癥的潛在價值。
 
結(jié)論和啟示
本研究通過條件性基因敲除、藥理學(xué)干預(yù)、細胞生物學(xué)和表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)（MeRIP-seq）等綜合分析方法，系統(tǒng)闡明了METTL3-SYK-ERK/MEK軸在ALI中的核心作用。關(guān)鍵結(jié)論包括：

• METTL3通過m6A修飾穩(wěn)定SYK mRNA，延長其半衰期；
• SYK持續(xù)表達激活ERK/MEK信號，驅(qū)動ROS產(chǎn)生和NETosis；
• 遺傳學(xué)和藥理學(xué)抑制METTL3均可減輕ALI病理表現(xiàn)。

MeRIP-seq在本研究中的重要作用
研究團隊通過比較WT與METTL3敲除中性粒細胞的MeRIP-seq數(shù)據(jù)，在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)繪制了m6A修飾圖譜。MeRIP-seq技術(shù)不僅幫助將表型關(guān)聯(lián)到ERK/MAPK等正確通路，更重要的是直接、精準地篩選出SYK作為METTL3的關(guān)鍵m6A修飾靶點。

關(guān)于易基因RNA m⁶A甲基化測序(MeRIP-seq)技術(shù)
易基因MeRIP-seq技術(shù)利用m⁶A特異性抗體富集發(fā)生m⁶A修飾的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），結(jié)合高通量測序，可以對RNA上的m⁶A修飾進行定位與定量，總RNA起始量可降低至10μg，最低僅需1μg總RNA。廣泛應(yīng)用于組織發(fā)育、干細胞自我更新和分化、熱休克或DNA損傷應(yīng)答、癌癥發(fā)生與發(fā)展、藥物應(yīng)答等研究領(lǐng)域；可應(yīng)用于動物、植物、細胞及組織的m⁶A檢測。

大樣本量m⁶A-QTL性狀關(guān)聯(lián)分析，傳統(tǒng)MeRIP單個樣品價格高，通常難以承擔(dān)。易基因開發(fā)建立MeRIP-seq2技術(shù)，顯著提成IP平行性，實現(xiàn)不同樣本間相對定量，降低檢測成本。

易基因提供適用于不同科研需求的MeRIP技術(shù)：

• m⁶A甲基化-常量mRNA 甲基化測序（MeRIP-seq）
• m⁶A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化測序（lnc-MeRIP-seq）
• m⁶A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化測序（Micro-lnc-MeRIP-seq）
• 高通量m⁶A甲基化-常量mRNA甲基化測序（MeRIP-seq2）

技術(shù)優(yōu)勢：

• 起始量低：樣本起始量可降低至10-20μg，最低僅需1μg總RNA；
• 轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)：可以同時檢測mRNA和lncRNA；
• 樣本要求：可用于動物、植物、細胞及組織的m⁶A檢測；
• 重復(fù)性高：IP富集重復(fù)性高，最大化降低抗體富集偏差；
• 應(yīng)用范圍廣：廣泛應(yīng)用于組織發(fā)育、干細胞自我更新和分化、熱休克或DNA損傷應(yīng)答、癌癥的發(fā)生與發(fā)展、藥物應(yīng)答等研究領(lǐng)域。

研究方向：
m⁶A甲基化目前主要運用在分子機制的理論性研究

• 疾病發(fā)生發(fā)展：腫瘤、代謝疾病（如肥胖/糖尿�。�、神經(jīng)和精神疾�。ㄈ绨�爾茲海默癥/抑郁癥）、炎癥…
• 發(fā)育和分化：早期胚胎發(fā)育、個體/組織/器官生長發(fā)育、干細胞分化與命運決定、衰老
• 環(huán)境暴露與響應(yīng)：污染、抗逆、生活方式

關(guān)于m⁶A甲基化研究思路
（1）整體把握m⁶A甲基化圖譜特征：m⁶A peak數(shù)量變化、m⁶A修飾基因數(shù)量變化、單個基因m⁶A peak數(shù)量分析、m⁶A peak在基因元件上的分布、m⁶A peak的motif分析、m⁶A peak修飾基因的功能分析
（2）篩選具體差異m⁶A peak和基因：差異m⁶A peak鑒定、非時序數(shù)據(jù)的分析策略、時序數(shù)據(jù)的分析策略、差異m⁶A修飾基因的功能分析、差異m⁶A修飾基因的PPI分析、候選基因的m⁶A修飾可視化展示
（3）m⁶A甲基化組學(xué)&轉(zhuǎn)錄組學(xué)關(guān)聯(lián)分析：Meta genes整體關(guān)聯(lián)、DMG-DEG對應(yīng)關(guān)聯(lián)、m⁶A修飾目標基因的篩選策略
（4）進一步驗證或后期試驗
   
參考文獻：Luo S, Zhang Q, Zhou W, Zhang L, Liao C, Zeng D, Zhang L, Xiang FL, Xu J, Tang J. METTL3 promotes neutrophil extracellular trap formation via SYK/ERK/MEK signaling during acute lung injury. J Adv Res. 2026 Jan 22. doi: 10.1016/j.jare.2026.01.044.