DNA甲基化決定小鼠雄性生殖細(xì)胞發(fā)育過程中的組蛋白修飾
近日，國際權(quán)威期刊《Nucleic Acids Research》發(fā)表了題為“DNA methylation dictates histone modifications in developing male germ cells in the mouse”的研究論文，對小鼠雄性生殖細(xì)胞發(fā)育過程中DNA甲基化與組蛋白修飾（H3K9me3和H3K4me3）在逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子沉默中的調(diào)控關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)研究。具體來說，研究通過比較野生型、去甲基化酶Dnmt3l敲除（de novo甲基化缺失）和piRNA生物發(fā)生關(guān)鍵基因Pld6（piRNA缺失）的小鼠模型，結(jié)合mRNA-seq、全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）和染色質(zhì)免疫共沉淀測序（ChIP-seq）等多組學(xué)測序技術(shù)，精準(zhǔn)評估了精原細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄、DNA甲基化及組蛋白修飾（H3K9me3和H3K4me3）狀態(tài)并揭示了在雄性精子發(fā)生過程中（尤其精母細(xì)胞階段），DNA甲基化是決定組蛋白修飾（維持抑制性H3K9me3，抑制激活性H3K4me3）和維持表觀基因組完整性的關(guān)鍵調(diào)控因子。
英文標(biāo)題：DNA methylation dictates histone modifications in developing male germ cells in the mouse
中文標(biāo)題：DNA甲基化決定小鼠雄性生殖細(xì)胞發(fā)育過程中的組蛋白修飾
發(fā)表時間：2025-11-20
發(fā)表期刊：Nucleic Acids Research
影響因子：IF13.1/Q1
技術(shù)平臺：mRNA-seq、WGBS、ChIP-seq等
DOI:10.1093/nar/gkaf1240
在哺乳動物雄性生殖細(xì)胞中，逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子表達(dá)受DNA甲基化、組蛋白修飾H3K9me3和PIWI互作小RNA（piRNA）共同調(diào)控。為闡明上述機(jī)制在生殖細(xì)胞發(fā)育過程中調(diào)控逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的相對重要性及相互關(guān)系，研究團(tuán)隊(duì)利用Dnmt3l突變體和Pld6突變體小鼠出生后第7天（P7）精原細(xì)胞和P21細(xì)線期/偶線期（L/Z）精母細(xì)胞進(jìn)行mRNA測序、DNA甲基化和組蛋白甲基化的多組學(xué)測序分析。結(jié)果顯示，DNA甲基化缺失導(dǎo)致年輕LINE-1（L1）亞家族中H3K9me3水平降低，并在大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中引起H3K4me3水平升高，表明DNA甲基化在維持精原細(xì)胞及精子發(fā)生后期階段的表觀基因組完整性中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，且DNA甲基化缺失導(dǎo)致的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄上調(diào)在生殖細(xì)胞減數(shù)分裂期（精母細(xì)胞）比減數(shù)分裂前（精原細(xì)胞）更為顯著。上述結(jié)果與精母細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子H3K9me3整體降低結(jié)果一致。此外，即使piRNA存在，DNA甲基化缺失仍導(dǎo)致相同逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子位點(diǎn)的H3K9me3降低和H3K4me3升高，表明piRNA系統(tǒng)也可能通過調(diào)控DNA甲基化在精原細(xì)胞中調(diào)控逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的H3K9me3和H3K4me3水平。
易小結(jié)
本研究在雄性生殖細(xì)胞表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域具有重要意義，不僅系統(tǒng)揭示了piRNA通過指導(dǎo)DNA甲基化以影響H3K9me3的層級關(guān)系，還闡明表觀遺傳沉默網(wǎng)絡(luò)在生殖細(xì)胞發(fā)育階段中進(jìn)行動態(tài)切換和相互協(xié)調(diào)。該成果為理解哺乳動物如何確保配子基因組的穩(wěn)定性和正確繼承，以及相關(guān)不育癥、轉(zhuǎn)座子激活相關(guān)疾病的機(jī)制提供了關(guān)鍵見解。
研究中WGBS和ChIP-seq（易基因金牌技術(shù)）等表觀基因組測序技術(shù)的綜合應(yīng)用，建立了從DNA修飾到組蛋白修飾的多維度表觀組圖譜，為后續(xù)研究提供了技術(shù)思路，展現(xiàn)了高通量測序在解析發(fā)育表觀遺傳動態(tài)中的關(guān)鍵作用。
研究方法
（1）小鼠模型與細(xì)胞分選
結(jié)果圖形
（1）部分逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在Pld6和Dnmt3l敲除精原細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)
研究首先通過mRNA-seq分析了P7精原細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的表達(dá)譜。在Pld6KO突變體中（圖1A），進(jìn)化上較年輕的L1亞家族顯著激活：L1Md_A_5end（包含啟動子、5'UTR和ORF1）上調(diào)40倍，L1_Mm_orf2和L1Md_A_3end分別上調(diào)12倍，L1Md_Gf_5end上調(diào)7倍。同時，內(nèi)源性A型顆粒（IAP）和MMERGLN家族的年輕LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子也分別上調(diào)達(dá)25倍和37倍。提示在Pld6KO（piRNA缺失）中，以L1Md_A_5end（年輕L1亞家族）和IAPEz/MMERGLN（年輕LTR）為代表的部分逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子表達(dá)顯著上調(diào)。
相比之下，Dnmt3lKO精原細(xì)胞（圖1C）表現(xiàn)出不同的激活模式：IAP和MMERGLN家族表現(xiàn)出更劇烈的轉(zhuǎn)錄激活（60-140倍），且與精母細(xì)胞中的激活程度相當(dāng)；然而，L1亞家族的激活程度顯著較低（僅4-14倍），遠(yuǎn)低于其在Dnmt3lKO精母細(xì)胞中的激活水平（39-127倍）。
通過對比兩種突變體（圖1E），研究發(fā)現(xiàn)Dnmt3lKO中IAP元件的激活程度高于Pld6KO，表明在精原細(xì)胞階段，DNA甲基化是LTR元件沉默的主要機(jī)制，而L1元件仍受piRNA系統(tǒng)的有效調(diào)控。這一結(jié)果提示，在發(fā)育過程中，逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子沉默從piRNA依賴的后轉(zhuǎn)錄調(diào)控向DNA甲基化依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)生轉(zhuǎn)變。
（2）單個逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子拷貝的DNA甲基化水平降低
為深入解析DNA甲基化的位點(diǎn)特異性變化，研究利用高覆蓋度WGBS數(shù)據(jù)（約7×和11×基因組覆蓋）對單個L1拷貝的啟動子區(qū)域（5'端，含串聯(lián)重復(fù)單體）進(jìn)行分析。分析結(jié)果顯示，在Dnmt3lKO中，大多數(shù)L1拷貝的甲基化水平顯著降低（圖2B）。而在Pld6KO中，L1群體呈現(xiàn)顯著雙峰分布（圖2A）：一群保持高甲基化（Pld6非依賴性），另一群則顯著去甲基化（Pld6依賴性）。進(jìn)一步分析表明，Pld6依賴性位點(diǎn)主要對應(yīng)進(jìn)化上較年輕的L1Md_A和L1Md_Gf亞家族，而較成熟的拷貝保持高甲基化（圖2C），這與SPOCD1-SPINC1-piRNA系統(tǒng)特異性靶向年輕L1啟動子的機(jī)制一致。
對于IAP元件的LTR區(qū)域（IAPLTR1_Mm），Pld6KO并未導(dǎo)致整體甲基化水平顯著下降（圖2D），僅個別位點(diǎn)出現(xiàn)去甲基化，提示piRNA對IAP的調(diào)控具有位點(diǎn)特異性。但在Dnmt3lKO中，研究觀察到顯著差異：5'和3' LTR保持高甲基化，而solo LTR（不含內(nèi)部序列的孤立LTR）則出現(xiàn)嚴(yán)重去甲基化（圖3A-C）。這種差異并非由局部GC含量導(dǎo)致（圖3D），而是源于原始生殖細(xì)胞（E13.5 PGCs）階段的全基因組去甲基化抵抗，完整IAP元件的5'/3' LTR在PGCs中保持高甲基化，而solo LTR則被去甲基化（圖3E）。因此，Dnmt3lKO精原細(xì)胞中的IAP甲基化模式反映了PGCs階段的“記憶”，表明de novo甲基化在精原細(xì)胞階段對solo LTR的de novo甲基化至關(guān)重要。
WGBS不僅證實(shí)了兩種突變體中DNA甲基化的整體丟失，還為理解piRNA和DNA甲基化對特定轉(zhuǎn)座子亞群和特定位點(diǎn)的特異性調(diào)控提供了直接證據(jù)。
（3）DNA甲基化缺失導(dǎo)致進(jìn)化上年輕的L1亞家族H3K9me3水平降低
為探究DNA甲基化與組蛋白修飾之間的因果關(guān)系，研究者進(jìn)行了H3K9me3的ChIP-seq分析。ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示，在Pld6KO和Dnmt3lKO精原細(xì)胞中，之前被WGBS鑒定為“Pld6依賴”的（即piRNA和DNA甲基化同時丟失的）年輕L1啟動子位點(diǎn)，其H3K9me3水平均顯著下降（圖4A）。而在兩種突變體中DNA甲基化都丟失的IAP、MMERVK10C和MMERGLN等LTR位點(diǎn)，其H3K9me3卻基本不受影響（圖4B-D）。這一發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要，表明DNA甲基化可以維持年輕L1位點(diǎn)（而非所有轉(zhuǎn)座子）的H3K9me3水平。結(jié)合ChIP-seq（圖6A）和WGBS（圖3E）數(shù)據(jù)，研究者推斷年輕L1拷貝在PGCs階段已獲得H3K9me3標(biāo)記，但在發(fā)育過程中，DNA甲基化丟失會導(dǎo)致該抑制性標(biāo)記丟失，提示了DNA甲基化對H3K9me3的維持作用。
（4）DNA甲基化缺失導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子H3K4me3水平增加
此外，研究者對激活性組蛋白標(biāo)記H3K4me3進(jìn)行了ChIP-seq分析。ChIP-seq數(shù)據(jù)明確顯示，在Pld6KO和Dnmt3lKO中，所有DNA甲基化降低的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子位點(diǎn)，無論是年輕的L1（圖4A、5C-D）還是IAP、MMERVK10C、MMERGLN等LTR元件（圖4B-D），其H3K4me3水平均顯著增加。這揭示了DNA甲基化的另一個關(guān)鍵功能：抑制激活性組蛋白標(biāo)記H3K4me3。結(jié)合發(fā)育數(shù)據(jù)（圖6B），這些位點(diǎn)在精原細(xì)胞期H3K4me3水平本來較低，但由于甲基化丟失導(dǎo)致其異常增加，可能進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活。H3K4me3的ChIP-seq分析完美補(bǔ)充了H3K9me3數(shù)據(jù)，共同描繪DNA甲基化如何雙向調(diào)控組蛋白修飾譜：維持抑制性（H3K9me3）并抑制激活性（H3K4me3），從而確保轉(zhuǎn)座子沉默。
（5）精母細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的H3K9me3水平降低
為理解不同發(fā)育階段的調(diào)控差異，研究者對L/Z期精母細(xì)胞也進(jìn)行了H3K9me3和H3K4me3的ChIP-seq分析，并與P7精原細(xì)胞的ChIP-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示，與精原細(xì)胞相比，野生型精母細(xì)胞中大部分逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（如L1Md_A_5end和IAPLTR1_Mm）的H3K9me3水平普遍降低，而H3K4me3水平略有上升（圖8A-B）。盡管兩種突變體在精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中引起的組蛋白修飾變化倍數(shù)相似（圖8C-F），但精母細(xì)胞中本就較低的H3K9me3基礎(chǔ)水平，介導(dǎo)DNA甲基化丟失造成的去抑制效應(yīng)（轉(zhuǎn)錄上調(diào)）在精母細(xì)胞階段表現(xiàn)得比精原細(xì)胞階段更為顯著（圖1F）。
上述研究結(jié)果表明，在生殖細(xì)胞發(fā)育過程中，表觀遺傳調(diào)控重心從主要依賴piRNA（在精原細(xì)胞中有效調(diào)控L1）轉(zhuǎn)向主要依賴DNA甲基化（在精母細(xì)胞中對所有轉(zhuǎn)座子類型都更為關(guān)鍵），這與精母細(xì)胞中H3.1/H3.2被不穩(wěn)定的H3t替換等染色質(zhì)環(huán)境改變相適應(yīng)。
結(jié)論和啟示
本研究通過ChIP-seq+WGBS+RNA-seq等分析揭示了DNA甲基化在小鼠雄性生殖細(xì)胞發(fā)育過程中對組蛋白修飾（如H3K9me3和H3K4me3）具有決定性調(diào)控作用。具體而言，piRNA通路通過指導(dǎo)DNA的de novo甲基化以介導(dǎo)年輕L1轉(zhuǎn)座子沉默，而DNA甲基化則負(fù)責(zé)維持這些位點(diǎn)H3K9me3并抑制H3K4me3。對于LTR轉(zhuǎn)座子，DNA甲基化則主要負(fù)責(zé)抑制H3K4me3。隨著發(fā)育進(jìn)程變化，表觀遺傳沉默網(wǎng)絡(luò)更依賴DNA甲基化，這一轉(zhuǎn)變確保在精子發(fā)生后期，即使組蛋白改變，轉(zhuǎn)座子也能長期有效抑制，從而保障配子基因組穩(wěn)定遺傳。
ChIP-seq和WGBS在本研究中的重要作用
ChIP-seq：在全基因組范圍內(nèi)動態(tài)繪制特定組蛋白修飾（H3K9me3和H3K4me3）的分布圖譜，直接證明DNA甲基化丟失如何導(dǎo)致年輕L1位點(diǎn)H3K9me3降低，以及所有丟失甲基化位點(diǎn)H3K4me3增加，揭示了DNA甲基化對組蛋白修飾的調(diào)控作用。同時通過比較精原細(xì)胞與精母細(xì)胞的ChIP-seq數(shù)據(jù)，闡明了組蛋白修飾景觀的發(fā)育動態(tài)變化。
WGBS：提供的CpG位點(diǎn)單堿基分辨率DNA甲基化全譜圖，不僅驗(yàn)證了兩種突變體模型中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的整體甲基化丟失，更通過量化的甲基化水平分析，精確定義哪些是“Pld6依賴”和“Pld6不依賴”位點(diǎn)，以及IAP的全長LTR與solo LTR甲基化差異。
ChIP-seq和WGBS的結(jié)合，清晰地刻畫出了“DNA甲基化丟失→H3K9me3下調(diào)&H3K4me3上調(diào)→轉(zhuǎn)錄激活→基因組穩(wěn)定性受損”的完整證據(jù)鏈。
參考文獻(xiàn)：Sugimoto H, Kawase M, Ichiyanagi K. DNA methylation dictates histone modifications in developing male germ cells in the mouse. Nucleic Acids Res. 2025 Nov 13;53(21) doi: 10.1093/nar/gkaf1240.
英文標(biāo)題：DNA methylation dictates histone modifications in developing male germ cells in the mouse
中文標(biāo)題：DNA甲基化決定小鼠雄性生殖細(xì)胞發(fā)育過程中的組蛋白修飾
發(fā)表時間：2025-11-20
發(fā)表期刊：Nucleic Acids Research
影響因子：IF13.1/Q1
技術(shù)平臺：mRNA-seq、WGBS、ChIP-seq等
DOI:10.1093/nar/gkaf1240
在哺乳動物雄性生殖細(xì)胞中，逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子表達(dá)受DNA甲基化、組蛋白修飾H3K9me3和PIWI互作小RNA（piRNA）共同調(diào)控。為闡明上述機(jī)制在生殖細(xì)胞發(fā)育過程中調(diào)控逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的相對重要性及相互關(guān)系，研究團(tuán)隊(duì)利用Dnmt3l突變體和Pld6突變體小鼠出生后第7天（P7）精原細(xì)胞和P21細(xì)線期/偶線期（L/Z）精母細(xì)胞進(jìn)行mRNA測序、DNA甲基化和組蛋白甲基化的多組學(xué)測序分析。結(jié)果顯示，DNA甲基化缺失導(dǎo)致年輕LINE-1（L1）亞家族中H3K9me3水平降低，并在大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中引起H3K4me3水平升高，表明DNA甲基化在維持精原細(xì)胞及精子發(fā)生后期階段的表觀基因組完整性中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，且DNA甲基化缺失導(dǎo)致的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄上調(diào)在生殖細(xì)胞減數(shù)分裂期（精母細(xì)胞）比減數(shù)分裂前（精原細(xì)胞）更為顯著。上述結(jié)果與精母細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子H3K9me3整體降低結(jié)果一致。此外，即使piRNA存在，DNA甲基化缺失仍導(dǎo)致相同逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子位點(diǎn)的H3K9me3降低和H3K4me3升高，表明piRNA系統(tǒng)也可能通過調(diào)控DNA甲基化在精原細(xì)胞中調(diào)控逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的H3K9me3和H3K4me3水平。
圖形摘要
易小結(jié)
本研究在雄性生殖細(xì)胞表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域具有重要意義，不僅系統(tǒng)揭示了piRNA通過指導(dǎo)DNA甲基化以影響H3K9me3的層級關(guān)系，還闡明表觀遺傳沉默網(wǎng)絡(luò)在生殖細(xì)胞發(fā)育階段中進(jìn)行動態(tài)切換和相互協(xié)調(diào)。該成果為理解哺乳動物如何確保配子基因組的穩(wěn)定性和正確繼承，以及相關(guān)不育癥、轉(zhuǎn)座子激活相關(guān)疾病的機(jī)制提供了關(guān)鍵見解。
研究中WGBS和ChIP-seq（易基因金牌技術(shù)）等表觀基因組測序技術(shù)的綜合應(yīng)用，建立了從DNA修飾到組蛋白修飾的多維度表觀組圖譜，為后續(xù)研究提供了技術(shù)思路，展現(xiàn)了高通量測序在解析發(fā)育表觀遺傳動態(tài)中的關(guān)鍵作用。
研究方法
（1）小鼠模型與細(xì)胞分選
- Dnmt3l敲除（KO） 和Pld6敲除（KO） 小鼠分別作為DNA de novo甲基化和piRNA生物發(fā)生缺失模型。
- 從出生后第7天（P7）的小鼠睪丸中分選出EpCAM陽性的精原細(xì)胞。從P21小鼠中分選出細(xì)線期/偶線期（L/Z）的精母細(xì)胞。
- 從野生型、雜合子和純合子KO小鼠的精原細(xì)胞中提取RNA進(jìn)行mRNA-seq測序分析，評估小鼠特異性逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子各亞家族的表達(dá)水平。
- 從野生型和Pld6KO精原細(xì)胞中提取基因組DNA，進(jìn)行WGBS測序分析，計(jì)算每個CpG位點(diǎn)的甲基化水平，并分析逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子位點(diǎn)的DNA甲基化狀態(tài)。
- 利用H3K9me3和H3K4me3抗體對P7精原細(xì)胞和P21的L/Z期精母細(xì)胞進(jìn)行ChIP-seq測序分析，計(jì)算逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子位點(diǎn)的ChIP富集度。
結(jié)果圖形
（1）部分逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在Pld6和Dnmt3l敲除精原細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)
研究首先通過mRNA-seq分析了P7精原細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的表達(dá)譜。在Pld6KO突變體中（圖1A），進(jìn)化上較年輕的L1亞家族顯著激活：L1Md_A_5end（包含啟動子、5'UTR和ORF1）上調(diào)40倍，L1_Mm_orf2和L1Md_A_3end分別上調(diào)12倍，L1Md_Gf_5end上調(diào)7倍。同時，內(nèi)源性A型顆粒（IAP）和MMERGLN家族的年輕LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子也分別上調(diào)達(dá)25倍和37倍。提示在Pld6KO（piRNA缺失）中，以L1Md_A_5end（年輕L1亞家族）和IAPEz/MMERGLN（年輕LTR）為代表的部分逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子表達(dá)顯著上調(diào)。
相比之下，Dnmt3lKO精原細(xì)胞（圖1C）表現(xiàn)出不同的激活模式：IAP和MMERGLN家族表現(xiàn)出更劇烈的轉(zhuǎn)錄激活（60-140倍），且與精母細(xì)胞中的激活程度相當(dāng)；然而，L1亞家族的激活程度顯著較低（僅4-14倍），遠(yuǎn)低于其在Dnmt3lKO精母細(xì)胞中的激活水平（39-127倍）。
通過對比兩種突變體（圖1E），研究發(fā)現(xiàn)Dnmt3lKO中IAP元件的激活程度高于Pld6KO，表明在精原細(xì)胞階段，DNA甲基化是LTR元件沉默的主要機(jī)制，而L1元件仍受piRNA系統(tǒng)的有效調(diào)控。這一結(jié)果提示，在發(fā)育過程中，逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子沉默從piRNA依賴的后轉(zhuǎn)錄調(diào)控向DNA甲基化依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)生轉(zhuǎn)變。
圖1：突變體中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的RNA表達(dá)。
（2）單個逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子拷貝的DNA甲基化水平降低
為深入解析DNA甲基化的位點(diǎn)特異性變化，研究利用高覆蓋度WGBS數(shù)據(jù)（約7×和11×基因組覆蓋）對單個L1拷貝的啟動子區(qū)域（5'端，含串聯(lián)重復(fù)單體）進(jìn)行分析。分析結(jié)果顯示，在Dnmt3lKO中，大多數(shù)L1拷貝的甲基化水平顯著降低（圖2B）。而在Pld6KO中，L1群體呈現(xiàn)顯著雙峰分布（圖2A）：一群保持高甲基化（Pld6非依賴性），另一群則顯著去甲基化（Pld6依賴性）。進(jìn)一步分析表明，Pld6依賴性位點(diǎn)主要對應(yīng)進(jìn)化上較年輕的L1Md_A和L1Md_Gf亞家族，而較成熟的拷貝保持高甲基化（圖2C），這與SPOCD1-SPINC1-piRNA系統(tǒng)特異性靶向年輕L1啟動子的機(jī)制一致。
對于IAP元件的LTR區(qū)域（IAPLTR1_Mm），Pld6KO并未導(dǎo)致整體甲基化水平顯著下降（圖2D），僅個別位點(diǎn)出現(xiàn)去甲基化，提示piRNA對IAP的調(diào)控具有位點(diǎn)特異性。但在Dnmt3lKO中，研究觀察到顯著差異：5'和3' LTR保持高甲基化，而solo LTR（不含內(nèi)部序列的孤立LTR）則出現(xiàn)嚴(yán)重去甲基化（圖3A-C）。這種差異并非由局部GC含量導(dǎo)致（圖3D），而是源于原始生殖細(xì)胞（E13.5 PGCs）階段的全基因組去甲基化抵抗，完整IAP元件的5'/3' LTR在PGCs中保持高甲基化，而solo LTR則被去甲基化（圖3E）。因此，Dnmt3lKO精原細(xì)胞中的IAP甲基化模式反映了PGCs階段的“記憶”，表明de novo甲基化在精原細(xì)胞階段對solo LTR的de novo甲基化至關(guān)重要。
WGBS不僅證實(shí)了兩種突變體中DNA甲基化的整體丟失，還為理解piRNA和DNA甲基化對特定轉(zhuǎn)座子亞群和特定位點(diǎn)的特異性調(diào)控提供了直接證據(jù)。
圖2：突變體中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的DNA甲基化。
圖3：IAP LTR序列的DNA甲基化。
（3）DNA甲基化缺失導(dǎo)致進(jìn)化上年輕的L1亞家族H3K9me3水平降低
為探究DNA甲基化與組蛋白修飾之間的因果關(guān)系，研究者進(jìn)行了H3K9me3的ChIP-seq分析。ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示，在Pld6KO和Dnmt3lKO精原細(xì)胞中，之前被WGBS鑒定為“Pld6依賴”的（即piRNA和DNA甲基化同時丟失的）年輕L1啟動子位點(diǎn)，其H3K9me3水平均顯著下降（圖4A）。而在兩種突變體中DNA甲基化都丟失的IAP、MMERVK10C和MMERGLN等LTR位點(diǎn)，其H3K9me3卻基本不受影響（圖4B-D）。這一發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要，表明DNA甲基化可以維持年輕L1位點(diǎn)（而非所有轉(zhuǎn)座子）的H3K9me3水平。結(jié)合ChIP-seq（圖6A）和WGBS（圖3E）數(shù)據(jù)，研究者推斷年輕L1拷貝在PGCs階段已獲得H3K9me3標(biāo)記，但在發(fā)育過程中，DNA甲基化丟失會導(dǎo)致該抑制性標(biāo)記丟失，提示了DNA甲基化對H3K9me3的維持作用。
圖4：突變體精原細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子位點(diǎn)的H3K9me3和H3K4me3修飾水平。
（4）DNA甲基化缺失導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子H3K4me3水平增加
此外，研究者對激活性組蛋白標(biāo)記H3K4me3進(jìn)行了ChIP-seq分析。ChIP-seq數(shù)據(jù)明確顯示，在Pld6KO和Dnmt3lKO中，所有DNA甲基化降低的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子位點(diǎn)，無論是年輕的L1（圖4A、5C-D）還是IAP、MMERVK10C、MMERGLN等LTR元件（圖4B-D），其H3K4me3水平均顯著增加。這揭示了DNA甲基化的另一個關(guān)鍵功能：抑制激活性組蛋白標(biāo)記H3K4me3。結(jié)合發(fā)育數(shù)據(jù)（圖6B），這些位點(diǎn)在精原細(xì)胞期H3K4me3水平本來較低，但由于甲基化丟失導(dǎo)致其異常增加，可能進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活。H3K4me3的ChIP-seq分析完美補(bǔ)充了H3K9me3數(shù)據(jù)，共同描繪DNA甲基化如何雙向調(diào)控組蛋白修飾譜：維持抑制性（H3K9me3）并抑制激活性（H3K4me3），從而確保轉(zhuǎn)座子沉默。
圖5：L1主要區(qū)域的H3K9me3和H3K4me3水平（亞家族水平分析）。
圖6：發(fā)育過程中Pld6依賴性L1拷貝的組蛋白甲基化修飾。
圖7：Setdb1、Dnmt3l和Pld6基因敲除突變效應(yīng)的比較（亞家族水平分析）。
（5）精母細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的H3K9me3水平降低
為理解不同發(fā)育階段的調(diào)控差異，研究者對L/Z期精母細(xì)胞也進(jìn)行了H3K9me3和H3K4me3的ChIP-seq分析，并與P7精原細(xì)胞的ChIP-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示，與精原細(xì)胞相比，野生型精母細(xì)胞中大部分逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（如L1Md_A_5end和IAPLTR1_Mm）的H3K9me3水平普遍降低，而H3K4me3水平略有上升（圖8A-B）。盡管兩種突變體在精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中引起的組蛋白修飾變化倍數(shù)相似（圖8C-F），但精母細(xì)胞中本就較低的H3K9me3基礎(chǔ)水平，介導(dǎo)DNA甲基化丟失造成的去抑制效應(yīng)（轉(zhuǎn)錄上調(diào)）在精母細(xì)胞階段表現(xiàn)得比精原細(xì)胞階段更為顯著（圖1F）。
上述研究結(jié)果表明，在生殖細(xì)胞發(fā)育過程中，表觀遺傳調(diào)控重心從主要依賴piRNA（在精原細(xì)胞中有效調(diào)控L1）轉(zhuǎn)向主要依賴DNA甲基化（在精母細(xì)胞中對所有轉(zhuǎn)座子類型都更為關(guān)鍵），這與精母細(xì)胞中H3.1/H3.2被不穩(wěn)定的H3t替換等染色質(zhì)環(huán)境改變相適應(yīng)。
圖8：P7精原細(xì)胞和P21精母細(xì)胞中的H3K9me3和H3K4me3水平（亞家族水平分析）
結(jié)論和啟示
本研究通過ChIP-seq+WGBS+RNA-seq等分析揭示了DNA甲基化在小鼠雄性生殖細(xì)胞發(fā)育過程中對組蛋白修飾（如H3K9me3和H3K4me3）具有決定性調(diào)控作用。具體而言，piRNA通路通過指導(dǎo)DNA的de novo甲基化以介導(dǎo)年輕L1轉(zhuǎn)座子沉默，而DNA甲基化則負(fù)責(zé)維持這些位點(diǎn)H3K9me3并抑制H3K4me3。對于LTR轉(zhuǎn)座子，DNA甲基化則主要負(fù)責(zé)抑制H3K4me3。隨著發(fā)育進(jìn)程變化，表觀遺傳沉默網(wǎng)絡(luò)更依賴DNA甲基化，這一轉(zhuǎn)變確保在精子發(fā)生后期，即使組蛋白改變，轉(zhuǎn)座子也能長期有效抑制，從而保障配子基因組穩(wěn)定遺傳。
ChIP-seq和WGBS在本研究中的重要作用
ChIP-seq：在全基因組范圍內(nèi)動態(tài)繪制特定組蛋白修飾（H3K9me3和H3K4me3）的分布圖譜，直接證明DNA甲基化丟失如何導(dǎo)致年輕L1位點(diǎn)H3K9me3降低，以及所有丟失甲基化位點(diǎn)H3K4me3增加，揭示了DNA甲基化對組蛋白修飾的調(diào)控作用。同時通過比較精原細(xì)胞與精母細(xì)胞的ChIP-seq數(shù)據(jù)，闡明了組蛋白修飾景觀的發(fā)育動態(tài)變化。
WGBS：提供的CpG位點(diǎn)單堿基分辨率DNA甲基化全譜圖，不僅驗(yàn)證了兩種突變體模型中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的整體甲基化丟失，更通過量化的甲基化水平分析，精確定義哪些是“Pld6依賴”和“Pld6不依賴”位點(diǎn)，以及IAP的全長LTR與solo LTR甲基化差異。
ChIP-seq和WGBS的結(jié)合，清晰地刻畫出了“DNA甲基化丟失→H3K9me3下調(diào)&H3K4me3上調(diào)→轉(zhuǎn)錄激活→基因組穩(wěn)定性受損”的完整證據(jù)鏈。
參考文獻(xiàn)：Sugimoto H, Kawase M, Ichiyanagi K. DNA methylation dictates histone modifications in developing male germ cells in the mouse. Nucleic Acids Res. 2025 Nov 13;53(21) doi: 10.1093/nar/gkaf1240.
- 空間轉(zhuǎn)錄組揭示腦垂體神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤進(jìn)展中參與腫瘤異質(zhì)性和免疫重塑
- DSP空間組學(xué)助力揭秘食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)生態(tài)演變空間分子圖譜
- 多肽檢測方法的對比及選型
- 文獻(xiàn)解讀：利用WGBS驗(yàn)證開發(fā)新型DNA甲基化編輯多功能分子工具箱
- 單細(xì)胞測序助力證實(shí)源自CD8+T細(xì)胞的IFN-γ為腫瘤微環(huán)境主要調(diào)節(jié)因子
- 生信分析大揭秘：4種組學(xué)常見流程與應(yīng)用前景全解析
- AF6敲除上調(diào)膽汁酸分泌促進(jìn)CXCL14介導(dǎo)的HCC抗腫瘤免疫
- 單細(xì)胞結(jié)合Xenium多模態(tài)解析中性粒細(xì)胞異質(zhì)性與空間調(diào)控機(jī)制
Copyright(C) 1998-2026 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com