基于像素內(nèi)雙點(diǎn)控制CMOS圖像傳感器的頻域熒光壽命成像
發(fā)光壽命作為一種有益的分析參數(shù)已知多年，許多出版物都對(duì)它作了很好的描述。在過去的幾年中，包括帶有攝像頭的二維測(cè)量系統(tǒng)在內(nèi)的許多儀器已經(jīng)被開發(fā)和應(yīng)用。然而，由于目前用于執(zhí)行時(shí)間域或頻域壽命測(cè)量的儀器相當(dāng)復(fù)雜，CMOS圖像傳感器技術(shù)的新發(fā)展已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了創(chuàng)建新的圖像傳感器，可以有效地集成到易于處理的發(fā)光壽命測(cè)量系統(tǒng)中。這些可調(diào)制CMOS圖像傳感器的原理，雖然最初是為距離測(cè)量而設(shè)計(jì)的，但與頻域 FLIM 測(cè)量有明顯的相似之處。基于這一原理，開發(fā)了新的CMOS圖像傳感器，并集成到相機(jī)系統(tǒng)中。
圖像傳感器的分辨率為1024×1024像素，間距為5.6pm，可調(diào)制高達(dá)50 MHz。第一次測(cè)量顯示有效動(dòng)態(tài)范圍大于1:1024(對(duì)應(yīng)于10位動(dòng)態(tài))。雙分接模式下的最大幀率在90幀/秒范圍內(nèi)，因此實(shí)際測(cè)量的有效終生圖像幀率約為22幀/秒。相機(jī)系統(tǒng)PCO.FLIM，其特征在于圖像傳感器，產(chǎn)生從5kHz到50MHz的所有所需調(diào)制信號(hào)(正弦和矩形)。它執(zhí)行先進(jìn)的像素校正，生成線性和高質(zhì)量的圖像，而基本的生命周期的圖像處理是在電腦中完成的。調(diào)制頻率可在規(guī)定范圍內(nèi)自由調(diào)節(jié)。
介紹了相機(jī)系統(tǒng)的特性，并討論了使用不同數(shù)據(jù)表示形式(例如相量法)的第一種結(jié)果。其建立的目的是為按像素劃分的熒光壽命數(shù)據(jù)提供更全面的視圖，并比較時(shí)域和頻域結(jié)果�；谶@些結(jié)果和正在進(jìn)行的測(cè)試的經(jīng)驗(yàn)，可以預(yù)期，pco.flim將大大簡(jiǎn)化將發(fā)光壽命成像系統(tǒng)引入更廣泛的應(yīng)用。
自20世紀(jì)90年代初以來，文中已經(jīng)描述了能夠測(cè)量熒光壽命空間分布的基于照相機(jī)的系統(tǒng)。與此同時(shí)，縮寫FLIM已成為既定術(shù)語熒光壽命成像熒光壽命成像顯微鏡。如何獲得熒光壽命圖像。從物理的角度來看，這可以在時(shí)域或頻域中實(shí)現(xiàn)。每種方法都表現(xiàn)出優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，這取決于光探測(cè)器的類型和所采用的采集方法。
在時(shí)域中，可以通過多種方法獲得熒光衰減。它是仿照通過適當(dāng)?shù)乃プ儠r(shí)間。對(duì)于成像應(yīng)用，采用掃描方法，由此商業(yè)“時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)”體系是弱發(fā)射染料的既定方法�？蛇x擇地，攝像機(jī)可用于在衰減曲線的短間隔內(nèi)集成熒光發(fā)射，然后結(jié)合一個(gè)或多個(gè)此類采集器在衰減的進(jìn)一步不同間隔內(nèi)計(jì)算壽命的空間分布。光子計(jì)數(shù)作為一種高靈敏度的方法，最適合于弱發(fā)光染料的發(fā)光檢測(cè)。它需要在獲取快速變化的光發(fā)射時(shí)避免失真，并準(zhǔn)確地測(cè)量通常較短的壽命。在熒光衰變進(jìn)行集成下，相機(jī)須具有極短的曝光時(shí)間，以便能夠檢測(cè)納秒范圍內(nèi)的壽命。對(duì)于目前的CMOS圖像傳感器來說，可用的最短曝光時(shí)間只有幾百納秒，這使得它們可以用干數(shù)百納秒的壽命測(cè)量，但對(duì)于納秒分辨率來說則不是。
使用pco.flim相機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行發(fā)光壽命成像的裝置的結(jié)構(gòu)概述。在圖中，當(dāng)相機(jī)為頻率控制器時(shí)，示出了使用pco.flim相機(jī)系統(tǒng)用于發(fā)光壽命成像的設(shè)置的結(jié)構(gòu)概述。pco.flim相機(jī)將調(diào)制信號(hào)和“暗”門信號(hào)發(fā)送到光源，光源應(yīng)該能夠接受這兩個(gè)信號(hào)。調(diào)制信號(hào)定義了激勵(lì)光的形狀，而柵極信號(hào)決定了激勵(lì)光通常是打開還是關(guān)閉，因?yàn)樵谧x取圖像時(shí)必須關(guān)閉燈。
根據(jù)操作模式和設(shè)置，相機(jī)系統(tǒng)pco.flim將通過USB3.0數(shù)據(jù)接口將圖像傳送到控制計(jì)算機(jī)。圖片所示的給定組件只是演示pco.flim系統(tǒng)靈活性的示例。由于攝像機(jī)包括調(diào)制信號(hào)的產(chǎn)生和控制，總體設(shè)置比較簡(jiǎn)單。
原則上，基于衰變或壽命的測(cè)量與強(qiáng)度的任何變化無關(guān)。然而，在進(jìn)行頻域測(cè)量時(shí)，必須注意有效地阻斷激發(fā)光。頻域FLIM測(cè)量了等效于激發(fā)信號(hào)和發(fā)射信號(hào)之間的時(shí)移的相位角�，F(xiàn)在，假設(shè)該信號(hào)是發(fā)射信號(hào)和例如激勵(lì)信號(hào)的10%的疊加(由于低效率阻塞)，則測(cè)量疊加信號(hào)的相位角該信號(hào)的相角在很大程度上取決于發(fā)光信號(hào)的相位角，但不幸的是，也取決于未阻塞激勵(lì)信號(hào)的強(qiáng)度和發(fā)射的強(qiáng)度之比。因此，在激發(fā)強(qiáng)度通常保持不變的情況下，發(fā)光強(qiáng)度的任何變化都會(huì)引入額外的相角，并可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。
德國(guó)Excelitas PCO公司pco.flim CMOS相機(jī)，具備高分辨率、高感光度、弱光成像的優(yōu)點(diǎn)，將顯微研究實(shí)驗(yàn)過程完美記錄，為實(shí)驗(yàn)提供強(qiáng)而有力的圖像數(shù)據(jù)支持。
廣州市元奧儀器有限公司作為德國(guó)Excelitas PCO公司攝像機(jī)在中國(guó)的代理商，為客戶提供各種成像系統(tǒng)解決方案，如對(duì)相關(guān)產(chǎn)品感到興趣，歡迎隨時(shí)聯(lián)系交流，公司網(wǎng)址：www.gzyaco.com、電話：400-860-2677。
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