細胞不貼壁的原因及附著因子適配的細胞類型與實驗指南

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細胞不貼壁？原因可能在這！

首先，要給大家介紹一下細胞外基質！

細胞外基質 (ECM) 是組織中由細胞分泌的非細胞部分，是一個錯綜復雜的蛋白質 3D 網狀結構，為細胞提供物理支撐并參與信號傳遞。

然而,一些細胞在體外培養(yǎng)時不容易分泌 ECM，因此很難粘附在培養(yǎng)載體表面，培養(yǎng)就很困難。

——通常會添加 ECM 來幫助細胞有效貼附到培養(yǎng)皿或其他載體上，模擬細胞與 ECM 之間的相互作用，這些 ECM 就被稱為附著因子。

知識鏈接

【附著因子】

- 通常指用于促進細胞粘附至培養(yǎng)表面或組織支架的蛋白質或分子。
- 這類因子可模擬天然細胞外基質 (ECM) 環(huán)境，為細胞提供錨定基礎，進而有效促進細胞的粘附、伸展、增殖與分化過程，對改善細胞生長狀態(tài)與行為具有顯著作用。
- 用途：干細胞培養(yǎng)、組織工程支架包被、以及需要優(yōu)良細胞附著條件的研究，其中附著因子在細胞培養(yǎng)中應用最為廣泛。

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常用附著因子？看看這幾種！

附著因子包括膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白等，它們通過與細胞表面的受體結合，構建起可提供結構支持并促進細胞通信的微環(huán)境，從而維持細胞的正常穩(wěn)態(tài)與調控^[2]。

1. 纖連蛋白

纖連蛋白 (Fibronectin, FN) 是位于細胞表面和血漿的大分子蛋白質，它能與細胞外基質成分 (如糖胺多糖、蛋白多糖和膠原蛋白) 及細胞表面受體結合，在胚胎發(fā)育、傷口愈合等生理過程中起重要作用。

2. 層粘連蛋白

層粘連蛋白 (Laminin) 主要存在于基膜的透明層，緊貼細胞基底表面，在神經生物學領域應用廣泛。  

功能方面，層粘連蛋白不僅參與調控細胞粘附、伸展、遷移和增殖等基本生物學過程，還能促進細胞分化與功能修飾，并顯著刺激神經突觸生長^[3][4]。

3. 膠原蛋白

膠原蛋白 (Collagen) 是重要生物高分子，是動物結締組織主要成分，也是哺乳動物體內含量最多、分布最廣的功能性蛋白質。

目前已發(fā)現 20 多種不同類型膠原蛋白，它們功能各異：纖維狀膠原蛋白 (如 I、II、III、V 和 XI 型) 主要在結締組織中；原纖維相關膠原蛋白 (如 IX 和 XII 型) 負責連接原纖維并介導其與細胞外基質相互作用；網絡形成型膠原蛋白 (如 IV 和 VII 型) 是基底層主要部分^[5][6]。

在細胞培養(yǎng)領域，因其優(yōu)異生物相容性，膠原蛋白被廣泛用于內皮細胞、肌肉細胞、肝細胞等多種細胞的體外培養(yǎng)體系。 

4. 明膠

明膠 (Gelatin) 是一種由膠原蛋白部分水解得到的大分子蛋白質，主要成分為甘氨酸、脯氨酸與羥脯氨酸^[7]。

它常被用作培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿的包被材料，可顯著提升胚胎干細胞、睪丸細胞等難貼壁細胞的附著效果，并為神經上皮樣結構等復雜細胞模型提供理想的生長環(huán)境。

5. 玻連蛋白

玻連蛋白 (Vitronectin, VN) 是由 478 個氨基酸構成的糖蛋白，主要存在于血液和細胞外基質中。

玻連蛋白能與糖胺多糖及蛋白多糖相互作用，充當細胞黏附分子。同時作為細胞溶解補體途徑的抑制劑，在凝血過程中發(fā)揮重要生理調節(jié)作用^[8]。

表1. 不同附著因子適配的細胞類型。

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附著因子？有點好用！

當然，如果您實在實在不確定咋選！先來瞅瞅咱家MCE的？！

有科研小伙伴在 FN-HAMA 的合成過程中，添加了購自 Med Chem Express 濃度為 50 μg/ml 的纖連蛋白 (HY-P70593)，效果嘎嘎好！

檢測 FN - HAMA 水凝膠對細胞黏附行為的調控作用，結果顯示：與未添加 FN 的 HAMA 水凝膠、FN 物理摻入的 FN/HAMA 水凝膠相比，FN - HAMA 水凝膠可顯著促進細胞黏附 (圖 2)，這與預期一致，原因在于 FN 對細胞黏附有優(yōu)異支持作用^[9]。 

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當然！纖連蛋白作為主要的細胞外基質蛋白之一，已被研究證實可顯著影響干細胞的特性 (如形態(tài)、黏附、分化)^[9]。

Patcharapa Tragoonlugkana 等的研究證實，采用纖連蛋白或玻連蛋白涂層的容器培養(yǎng)脂肪來源干細胞 (ADSCs)，可顯著優(yōu)化培養(yǎng)效果^[10]。

相較于常規(guī)培養(yǎng) (對照組)，FN/VN 涂層能顯著增強 ADSCs 的粘附與增殖能力： ADSCs 接種 12 小時后，FN 涂層組與 VN 涂層組的細胞粘附率均顯著高于對照組 (圖 3A)，凸顯了附著因子對細胞貼壁的強力促進作用；通過群體倍增時間 (PDT) 評估細胞周期活性發(fā)現，在 P5、P7 及 P10 連續(xù)傳代過程中，FN 與 VN 涂層組的 PDT 值均明顯低于對照組 (圖 3B)，進一步證實附著因子可通過加速細胞周期進程顯著提升增殖效率。

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實驗指南？難不住的！

附著因子的核心用法很簡單，就是提前給培養(yǎng)器皿做包被預處理，包被的濃度決定了細胞粘附的能力。下面整理了簡單的包被步驟，附避坑 Tips，直接抄作業(yè)！

操作流程^[10]

『實驗準備』

取一支附著因子儲液緩慢解凍，使用無菌 PBS (pH 7.2–7.4) 或無血清培養(yǎng)基將其稀釋至最佳工作濃度。

Tips：可通過預實驗確定適用于目的細胞的包被組分及濃度。Ⅰ 型膠原蛋白的常用稀釋濃度為 5–20 μg/mL，纖連蛋白的常用稀釋濃度為 1–5 μg/mL。

『加液包被』

根據器皿規(guī)格加入足量包被液，確保其完全覆蓋器皿底部。輕輕晃動器皿，使液體均勻分布且無氣泡殘留。

Tips：不同規(guī)格培養(yǎng)器皿的包被液添加量如下：96 孔板每孔 50-100 μL，6 孔板每孔 800 μL，T25 培養(yǎng)瓶 2.5 mL。

『孵育』

常規(guī)采用 4℃ 過夜孵育，吸附效果最均勻，適用于干細胞、原代細胞；若需快速實驗，可選擇 37℃ 培養(yǎng)箱孵育 1–2 小時。

Tips：多聚賴氨酸可在室溫下孵育 30 分鐘以上；層粘連蛋白需避免干燥，4℃ 過夜孵育效果更佳。

『洗滌』

吸除包被液，用無菌 PBS 緩沖液輕柔洗滌 3 次，以去除未結合的殘留蛋白。

『封閉』

加入 1% BSA，于 37℃ 孵育 1 小時進行封閉處理，隨后用 PBS 洗滌 3 次，以阻斷非特異性結合位點。

『接種細胞』

培養(yǎng)狀態(tài)良好的細胞經胰酶消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸，按適宜接種密度接種至已完成包被的孔板中。

Tips：初次實驗需設置陽性對照、陰性對照及空白對照組：陽性對照使用未包被的培養(yǎng)器皿，或采用已知的高粘附細胞系/包被條件；空白對照為僅添加培養(yǎng)基而不接種細胞的組別，用于評估背景干擾。

『細胞培養(yǎng)』

37℃ 孵育至預設時間點 (如 20 分鐘/40 分鐘/1 小時)，隨后用 PBS 輕柔潤洗 3 次，以去除未粘附的細胞。

Tips：細胞粘附的最佳孵育時間可能因細胞類型及其他實驗參數而異，可通過預實驗確定；對于粘附能力較強的細胞，需適當縮短孵育時間。

結果檢測

體外測定粘附細胞數量時，比色法與熒光法是兩大主流技術選擇，二者原理各異，且各有其適配的應用場景。

『比色法』

『原理』：結晶紫陽離子可與細胞 DNA 的磷酸基團發(fā)生靜電結合，使細胞呈現紫色^[10]。

『操作』：采用 4% 多聚甲醛固定 15 分鐘→0.1% 結晶紫染色→Triton/SDS 裂解→通過酶標儀分別讀取 550 nm (對應 SDS 處理組) 或 595 nm (對應 Triton 處理組) 處的吸光度值，吸光度越高，說明粘附的細胞數量越多。

『特點』：該方法成本較低、重復性良好，適用于批量樣本的檢測。

『熒光法』

『原理』：活細胞內的酯酶可將無熒光的鈣黃綠素-AM 水解為發(fā)強綠光的鈣黃綠素 (激發(fā)光波長 494 nm，發(fā)射光波長 517 nm)^[11]。

『操作』：洗去未粘附細胞→每孔加入 200 μL PBS →使用熒光顯微鏡或酶標儀檢測熒光→計算“貼壁細胞熒光值/總細胞熒光值”的比值，以此確認粘附細胞的數量。

Tip：適用于活細胞的精準檢測。

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參考文獻：
[1] Surat P. Structure and Function of Proteoglycans. News-Medical (Life Sciences). 2019.
[2] Mogha P, et al. Extracellular matrix protein gelatin provides higher expansion, reduces size heterogeneity, and maintains cell stiffness in a long-term culture of mesenchymal stem cells. Tissue Cell. 2023;80:101969.
[3] Holmberg J, et al. Laminin-211 in skeletal muscle function. Cell Adh Migr. 2013;7(1):111-121. 
[4] Singh B, et al. Human pathogens utilize host extracellular matrix proteins laminin and collagen for adhesion and invasion of the host. FEMS Microbiol Rev. 2012;36(6):1122-1180. 
[5] Shahrajabian MH, et al. Mechanism of Action of Collagen and Epidermal Growth Factor: A Review on Theory and Research Methods. Mini Rev Med Chem. 2024;24(4):453-477. 
[6] Holmes DF, et al. Collagen Fibril Assembly and Function. Curr Top Dev Biol. 2018;130:107-142.
[7] Ahmad MI, et al. Collagen and gelatin: Structure, properties, and applications in food industry. Int J Biol Macromol. 2024;254(Pt 3):128037.
[8] Pellegrini A, et al. Recruitment of Vitronectin by Bacterial Pathogens: A Comprehensive Overview. Microorganisms. 2024;12(7):1385. Published 2024 Jul 8.
[9] Wu X, et al. Stem cell niche-inspired microcarriers with ADSCs encapsulation for diabetic wound treatment. Bioact Mater. 2023 Mar 3;26:159-168. 
[10] Lazarovici P, et al. Cell-Based Adhesion Assays for Isolation of Snake Venom's Integrin Antagonists. Methods Mol Biol. 2020;2068:205-223. 
[11] Liu P, et al. Inflammatory Smooth Muscle Cells Induce Endothelial Cell Alterations to Influence Cerebral Aneurysm Progression via Regulation of Integrin and VEGF Expression. Cell Transplant. 2019;28(6):713-722.