衰老及阿爾茨海默病中前額葉皮層的立體空間轉(zhuǎn)錄組測序研究

文獻摘要：
阿爾茨海默�。ˋD）是老齡化社會中最常見的癡呆類型，其病理機制復(fù)雜且與正常衰老的界限模糊，給臨床診療帶來巨大挑戰(zhàn)。前額葉皮層（PFC）是 AD 病理損傷的核心腦區(qū)，傳統(tǒng)研究手段難以同步捕獲其分子表達特征與空間分布信息。本研究采用亞細胞分辨率的 Stereo-seq 技術(shù)，構(gòu)建 AD 患者與年齡匹配對照者 PFC 的空間轉(zhuǎn)錄組圖譜，系統(tǒng)解析皮層分層結(jié)構(gòu)紊亂、細胞類型特異性轉(zhuǎn)錄變化及細胞間通訊異常，篩選出關(guān)鍵調(diào)控因子與神經(jīng)保護模塊，為區(qū)分 AD 與正常衰老、開發(fā)新型治療靶點提供突破性見解。

實驗結(jié)果：

1、PFC 空間轉(zhuǎn)錄組圖譜構(gòu)建與皮層分層鑒定
本研究納入 6 例男性 AD 患者及 6 例年齡匹配男性對照，統(tǒng)一采集前額葉皮層 BA10 區(qū)組織樣本，建立標準化研究隊列（圖 1A）。免疫組織化學(xué)（IHC）染色明確病理差異：正常衰老（NA）組（B01809A3）幾乎無 Aβ 斑塊沉積，中度 AD 組（B01809C2）可見少量紅色 Aβ 斑塊，重度 AD 組（A02092E1）則表現(xiàn)為大量 Aβ 斑塊聚集；無監(jiān)督聚類結(jié)果與 H&E 染色組織學(xué)結(jié)構(gòu)高度吻合，驗證了分層鑒定的可靠性（圖 1B）。UMAP 可視化分析清晰呈現(xiàn) 7 個聚類（L1-L6 + 白質(zhì) WM），直觀反映不同皮層分層及白質(zhì)區(qū)域的轉(zhuǎn)錄組差異特征（圖 1C）。富集基因表達熱圖進一步量化各聚類的分子表達水平，為后續(xù)分層特異性分析奠定核心數(shù)據(jù)基礎(chǔ)（圖 1D）。本研究不僅驗證了 AQP4（L1 層）、HPCAL1（L2/3 層）、PCP4（L5 層）等經(jīng)典皮層分層標志物的空間表達模式，還新挖掘出 MT-RNR2（L1 層）、TMEM59L（L2/3 層）等未報道的層特異性標志物，豐富了 PFC 皮層分層的分子標識體系（圖 1E、1F）

2、AD 進展中皮層分層結(jié)構(gòu)紊亂與區(qū)域特異性轉(zhuǎn)錄異常
隨著 AD 病情進展，皮層分層結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)顯著紊亂：重度 AD 患者 L2-L6 層占比顯著降低，L1 層占比由 13.9% 升至 22.9%，直觀反映前額葉皮層的萎縮特征（圖 2A-B）。星形膠質(zhì)細胞激活標志物 GFAP 與 NEAT1 在重度 AD 組均呈高表達（校正后 P 值均為 0.0），提示 L1 層占比升高或與神經(jīng)元降解及膠質(zhì)細胞激活密切相關(guān)（圖 2C）。差異基因分析顯示，AD 組下調(diào)基因數(shù)量顯著多于上調(diào)基因，且晚期上調(diào)基因多富集于線粒體功能相關(guān)通路，揭示 AD 進展過程中存在全局性線粒體功能障礙（圖 2D-E）。值得注意的是，白質(zhì)區(qū)域作為 AD 早期病變的敏感區(qū)域，在疾病早期即出現(xiàn)髓鞘維持基因 MBP、突觸功能基因 SNAP25 的顯著下調(diào)，提示白質(zhì)病變可能是 AD 早期核心病理特征之一（圖 2E）。

 

3、單細胞分辨率下高應(yīng)激神經(jīng)元的定位與特征鑒定

細胞通訊分析發(fā)現(xiàn)，AD 患者細胞間相互作用數(shù)量隨病情進展持續(xù)減少，由正常衰老組的 3571 個降至重度 AD 組的 2244 個，直觀呈現(xiàn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接逐步崩潰的動態(tài)過程（圖 3A）。熱圖對比結(jié)果顯示，L4-L5 層間相互作用及 L4-L6 層信號輸出顯著減少；此類垂直網(wǎng)絡(luò)是維持認知功能的核心結(jié)構(gòu)，其破壞或直接誘發(fā)認知損傷（圖 3B）。關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)信號通路的損傷尤為顯著：L5 層（主要輸出層）向其他皮層分層傳導(dǎo)的 SLC1A2-GRIA2（谷氨酸信號通路）、NRXN3-CLSTN1（突觸分化相關(guān)）等核心配體 - 受體互作，在中度 AD 組顯著減弱，至重度 AD 組則完全消失，這為認知衰退的分子機制提供了直接實驗依據(jù)（圖 3C）。

 

4、單細胞分辨率下高應(yīng)激神經(jīng)元的定位與特征鑒定

在 bin50 分辨率下，本研究注釋出星形膠質(zhì)細胞（Ast）、興奮性神經(jīng)元（Ex）等 7 類核心細胞類型，并明確 Ex 主要分布于新皮質(zhì)、少突膠質(zhì)細胞（Oli）富集于白質(zhì)的空間分布特征（圖 4A-C）。以線粒體基因占比≥15% 為判定閾值，研究鑒定出高應(yīng)激 Ex 亞群：該亞群在重度 AD 組占比高達 75.28%，而正常衰老組僅為 0.13%，這一顯著差異提示 AD 晚期神經(jīng)元應(yīng)激狀態(tài)呈廣泛性激活（圖 4F）。高應(yīng)激 Ex 所在區(qū)域同步高表達星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP、AQP4（校正后P值均為 0.0），表明神經(jīng)元處于高應(yīng)激狀態(tài)時，鄰近膠質(zhì)細胞會被激活并向受損區(qū)域遷移，進而發(fā)揮潛在支持作用（圖 4G）。差異基因分析進一步揭示高應(yīng)激神經(jīng)元的分子特征：MT-RNR2等線粒體相關(guān)基因表達上調(diào)，而ENC1、CALM2等神經(jīng)保護基因表達顯著下調(diào)（圖 4G）。

 

5、單細胞核水平的空間特異性轉(zhuǎn)錄應(yīng)答與代償機制

本研究首先對所有細胞核進行聚類分析（圖 5A），并通過標記基因?qū)⑵渥⑨尀榕d奮性神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞等主要細胞類型（圖 5B），其空間分布與解剖結(jié)構(gòu)高度一致（圖 5C）。為解析細胞對 “高應(yīng)激焦點” 的應(yīng)答模式，研究以該焦點為中心，將周邊細胞核按距離劃分為三個同心圓層級（Level I 距離最近，Level III 距離最遠）（圖 5D），并基于此分組開展針對性分析。組內(nèi)比較結(jié)果顯示，正常衰老（NA）組中，緊鄰應(yīng)激焦點的神經(jīng)元會特異性上調(diào)神經(jīng)保護基因；而重度 AD 組中該調(diào)控模式完全消失，轉(zhuǎn)而呈現(xiàn)熱休克蛋白等全局應(yīng)激基因的普遍性上調(diào)（圖 5E）。組間比較發(fā)現(xiàn)，隨著 AD 病情進展，即便處于最靠近應(yīng)激焦點的前沿區(qū)域（Level I），各類細胞中 PSAP 等關(guān)鍵神經(jīng)保護因子的表達也顯著下調(diào)，提示其神經(jīng)保護功能發(fā)生衰竭（圖 5F）。

 

6、細胞間通訊網(wǎng)絡(luò)破壞與 Aβ 清除能力下降

細胞間通訊分析顯示，正常衰老組 L1 層細胞的配體 - 受體對數(shù)量及互作強度顯著高于 L3 層，形成高效的保護性細胞互作網(wǎng)絡(luò)（圖 6A-B）。而 AD 組中，PSAP-GPR37L1（神經(jīng)保護通路）、APP-CD74（Aβ 抑制通路）等核心配體 - 受體互作顯著減弱甚至完全消失，直接造成神經(jīng)保護功能與 Aβ 清除能力的雙重受損（圖 6C-E）。興奮性神經(jīng)元（Ex）與星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞間的保護性互作，在重度 AD 階段近乎完全斷裂，這或為 Aβ 沉積加劇及神經(jīng)元退行性降解的重要誘因（圖 6D-E）。

 

7、神經(jīng)保護基因模塊鑒定與關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子篩選

通過加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA），本研究在興奮性神經(jīng)元（Ex）與抑制性神經(jīng)元（Inh）中鑒定出 4 個核心基因模塊（Ex1、Ex2、Inh1、Inh2），其中 Ex1、Inh1 及 Inh2 模塊與 AD 病情進展呈顯著負相關(guān)（圖 7A）。GO 功能富集分析表明，這三個模塊共同構(gòu)成神經(jīng)保護調(diào)控網(wǎng)絡(luò)：Ex1 模塊富集 Aβ 形成負調(diào)控、蛋白去磷酸化等功能，Inh1 模塊參與突觸傳遞調(diào)控及 Aβ 應(yīng)答過程，Inh2 模塊則與 Aβ 清除功能密切相關(guān)（圖 7D）。轉(zhuǎn)錄因子富集分析顯示，ZNF460 在上述三個核心模塊中的富集程度最高，同時 KLF4、KLF5 等促 AD 進展轉(zhuǎn)錄因子亦在模塊中富集，揭示了 AD 進展過程中復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制（圖 7E）。其中，ZNF460 作為核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可能通過調(diào)控神經(jīng)保護基因模塊參與 AD 病理進程，為新型治療靶點的開發(fā)提供了重要方向。

 

結(jié)論：

本研究依托 Stereo-seq 技術(shù)的高分辨率優(yōu)勢，結(jié)合明確的樣本隊列特征，首次在空間維度完整勾勒出 AD 患者前額葉皮層（PFC）的分子病理全景。通過圖表對應(yīng)分析，明確皮層分層結(jié)構(gòu)紊亂、細胞應(yīng)激水平升高、細胞間通訊網(wǎng)絡(luò)塌陷及神經(jīng)保護模塊下調(diào)，是 AD 病情進展的核心病理特征。本研究不僅精準界定了 AD 與正常衰老的轉(zhuǎn)錄組差異，還發(fā)現(xiàn)以 ZNF460 為核心的關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為解析 AD 發(fā)病機制提供了全新視角。這些研究發(fā)現(xiàn)將為 AD 早期診斷標志物的研發(fā)及精準治療策略的制定提供重要支撐，為攻克這一神經(jīng)退行性疾病注入新的希望。

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