組織透明化聯(lián)合多光子顯微鏡技實(shí)現(xiàn)1毫米肌肉樣本高分辨率三維成像

本研究針對杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）這一嚴(yán)重影響肌肉功能的遺傳性疾病，開發(fā)了一種創(chuàng)新的三維成像與分析方法，旨在深入揭示病變骨骼肌中血管網(wǎng)絡(luò)與纖維化組織的復(fù)雜空間重構(gòu)。傳統(tǒng)二維組織學(xué)分析難以全面捕捉肌肉組織中血管、肌纖維和膠原網(wǎng)絡(luò)之間的立體交互關(guān)系，而本研究通過整合多光子顯微鏡技術(shù)（包括二次諧波發(fā)生和雙光子激發(fā)熒光）與組織透明化方法，成功實(shí)現(xiàn)了對厚肌樣本的高分辨率三維成像，并結(jié)合深度學(xué)習(xí)算法進(jìn)行定量分析，為理解DMD病理機(jī)制提供了全新的視角。

本研究成果由Ibrahim Hassani、Mireille Ledevin、Chantal Thorin、Tony Fiore、Marie-Anne Colle、Karl Rouger及Laurence Dubreil共同完成，以題為“Multiphoton microscopy and tissue clearing for 3D characterization of the vasculature and fibrosis remodeling in rat dystrophic skeletal muscle”的論文形式，于2025年10月發(fā)表于《Scientific Reports》期刊平臺。

重要發(fā)現(xiàn)
01血管網(wǎng)絡(luò)在肌營養(yǎng)不良肌肉中發(fā)生顯著三維重構(gòu)
本研究通過對1歲齡野生型（WT）與肌營養(yǎng)不良（DMDmdx）大鼠的股二頭肌樣本進(jìn)行系統(tǒng)比較，揭示了病變肌肉中微血管系統(tǒng)的深刻空間重組。在傳統(tǒng)的二維分析中，盡管微血管密度等全局參數(shù)在兩組間未顯示出顯著差異，但一個稱為“共享因子”的指標(biāo)——即單個微血管所服務(wù)的肌纖維數(shù)量——在DMDmdx大鼠中顯著升高，暗示了血管資源分配的異常。

然而，當(dāng)研究轉(zhuǎn)入三維層面，更復(fù)雜的圖景才得以展現(xiàn)。借助組織透明化技術(shù)（結(jié)合iDISCO+和CUBIC協(xié)議），研究人員能夠?qū)�厚達(dá)1毫米的肌肉樣本進(jìn)行成像，穿透深度遠(yuǎn)超傳統(tǒng)顯微鏡的極限（約150微米）。通過雙光子激發(fā)熒光（TPEF）對凝集素標(biāo)記的血管進(jìn)行成像，并結(jié)合深度學(xué)習(xí)模型（如U-Net架構(gòu)的Segment.ai模塊）對血管網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行自動分割和三維重建，研究發(fā)現(xiàn)DMDmdx肌肉中的血管網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)出高度的無序性：與野生型肌肉中平行于肌纖維的規(guī)則走向不同，病變肌肉中的血管分支雜亂無章。定量分析進(jìn)一步證實(shí)，DMDmdx肌肉中的血管分支數(shù)量顯著增加，而單個微血管的長度顯著縮短，直徑也略有減小。尤為關(guān)鍵的是，血管與肌纖維之間的接觸表面積在病變肌肉中大幅減少，這表明營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣交換的關(guān)鍵界面受到了嚴(yán)重?fù)p害。

通過將血管（TPEF信號）和膠原（SHG信號）的三維圖像進(jìn)行空間疊加分析，研究取得了關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：在DMDmdx肌肉中，有高達(dá)10.07%的微血管體積被膠原網(wǎng)絡(luò)所包裹，而在野生型肌肉中這一比例僅為1.79%。

這種“血管被纖維化組織包裹”的現(xiàn)象，直觀地展示了纖維化如何從物理空間上隔離血管與肌纖維，很可能加劇了血管功能障礙和肌肉缺血，從而形成一個惡性的病理循環(huán)。

創(chuàng)新與亮點(diǎn)
本研究的首要創(chuàng)新點(diǎn)在于成功突破了傳統(tǒng)二維組織學(xué)在分析復(fù)雜三維生物結(jié)構(gòu)時的局限。它通過將多光子顯微鏡（SHG/TPEF）與先進(jìn)的組織透明化技術(shù)（iDISCO+/CUBIC）有機(jī)融合，構(gòu)建了一套能夠?qū)Σ煌该�、高散射的病理肌肉組織進(jìn)行深度（可達(dá)1毫米）、高對比度、多參數(shù)同步成像的技術(shù)體系。這一技術(shù)組合有效克服了光在生物組織中散射導(dǎo)致的成像深度淺、圖像質(zhì)量差的核心難題。

其次，該研究提出并驗(yàn)證了一種基于深度學(xué)習(xí)的三維圖像分析新策略。相較于依賴人工判讀或簡單閾值分割的傳統(tǒng)方法，這種智能化的分割與量化流程能夠更精準(zhǔn)地捕捉到諸如血管網(wǎng)絡(luò)細(xì)微分支、膠原纖維復(fù)雜形態(tài)等亞結(jié)構(gòu)特征，從而揭示出在二維切片中根本無法觀測到的空間關(guān)系變化，例如血管被膠原網(wǎng)絡(luò)包裹的程度。

在光學(xué)生物醫(yī)療領(lǐng)域的實(shí)際價值方面，這套“成像-透明-分析”一體化技術(shù)方案展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。它不僅為DMD等肌肉疾病的基礎(chǔ)研究提供了前所未有的細(xì)節(jié)洞察，幫助科學(xué)家更全面地理解疾病進(jìn)展中血管退化與纖維化加劇之間的相互作用機(jī)制，更重要的是，它為未來開發(fā)針對血管生成和抗纖維化的治療策略提供了一個強(qiáng)大的藥效評估平臺。在臨床前研究中，利用該技術(shù)可以無創(chuàng)、定量地監(jiān)測藥物治療后肌肉微環(huán)境的三維結(jié)構(gòu)改善情況，從而加速新療法的開發(fā)與優(yōu)化進(jìn)程。

總結(jié)與展望
本研究通過發(fā)展并應(yīng)用一種結(jié)合多光子顯微鏡、組織透明化和深度學(xué)習(xí)分析的三維成像技術(shù)，清晰地揭示了肌營養(yǎng)不良骨骼肌中血管網(wǎng)絡(luò)的高度無序、分支增多以及與肌纖維接觸減少的特征，同時定量證實(shí)了纖維化組織顯著增加并包裹血管的空間現(xiàn)象。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了血管功能異常與纖維化進(jìn)程在DMD病理中的緊密關(guān)聯(lián)，為理解該疾病提供了新的三維結(jié)構(gòu)證據(jù)。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Hassani I, Ledevin M, Thorin C, Fiore T, Colle MA, Rouger K, Dubreil L. Multiphoton microscopy and tissue clearing for 3D characterization of the vasculature and fibrosis remodeling in rat dystrophic skeletal muscle. Sci Rep. 2025 Oct 21;15(1):36686.
DOI:10.1038/s41598-025-20335-9.