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高速SCMOS斜面顯微鏡在心肌細(xì)胞鈣動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：288　發(fā)布日期：2026-1-16　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

（論文部分內(nèi)容摘抄）

斜面顯微鏡(OPM)是一種光片顯微鏡，它使用單個(gè)高數(shù)值孔徑顯微鏡目標(biāo)物進(jìn)行熒光激發(fā)和收集。本文介紹了OPM的相對(duì)收集效率的測(cè)量方法然后引入一個(gè)包含兩個(gè)sCMOS相機(jī)的OPM系統(tǒng)使單個(gè)分離的心肌細(xì)胞能夠以每秒667幀的960x200像素連續(xù)研究22秒，以每秒960x200像元連續(xù)研究30秒。960x200X20個(gè)體素，每秒25卷。在這兩種情況下，OPM能夠記錄在兩個(gè)光譜通道，使細(xì)胞內(nèi)鈣通過(guò)探針與肌膜和橫管網(wǎng)絡(luò)通過(guò)膜染料同時(shí)進(jìn)行研究。OPM系統(tǒng)，然后被應(yīng)用到確定自發(fā)鈣波的空間起源，并測(cè)量其起源點(diǎn)的細(xì)胞橫向小管結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步的結(jié)果表明，OPM系統(tǒng)也可以用于研究鈣火花參數(shù)，取決于它們與橫向小管結(jié)構(gòu)的關(guān)系。

圖為系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)配置示出在樣品平面中放置一個(gè)熒光球(藍(lán)色)。球體中激發(fā)熒光的區(qū)域用綠色表示。球面像是在光學(xué)系統(tǒng)的像面上成像的。詳見(jiàn)正文。M鏡、直流二向色放大器、AOTF聲光可調(diào)濾光片、單模光纖、L-球面透鏡、C-圓柱透鏡、FP-前焦平面、BFP-后焦平面、0-顯微鏡物鏡、TL-顯微管透鏡、EM-發(fā)射濾光片。

Fluo-4和CMO的激發(fā)波長(zhǎng)分別為488nm和561nm。在01的后孔處，每個(gè)波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的激發(fā)功率約為280 uW。該功率分布在覆蓋整個(gè)系統(tǒng)視場(chǎng)寬度的照明片上(氧氣限制為400um)，比sCMOS相機(jī)拍攝的234x49um的視場(chǎng)要大。

每個(gè)2-D采集包括每個(gè)sCMOS相機(jī)上的15,000幀960x200像素。相機(jī)集成時(shí)間被設(shè)置為1.46毫秒幀間時(shí)間為1.5毫秒，從而達(dá)到每秒667幀的同步采集率，總持續(xù)時(shí)間為22.5秒。這兩個(gè)圖像堆棧表示不同信道被同步獲取，然后使用從美國(guó)空軍1951年測(cè)試圖的圖像確定的校正參數(shù)共同登記。

圖2心肌細(xì)胞內(nèi)t管位置的識(shí)別。((a)單個(gè)分離心肌梗死心肌細(xì)胞的CMO圖像。紅色表示CMO的熒光強(qiáng)度，白色表示感興趣的肌膜區(qū)(ROI)。(B)圖A所示圖像的傅里葉變換。圖A中紅色交叉點(diǎn)位置是手動(dòng)定位的高空間頻率，對(duì)應(yīng)于t-管結(jié)構(gòu)。圖B中紅色交點(diǎn)位置對(duì)應(yīng)于t管結(jié)構(gòu)。(C)和(D)分別為單側(cè)和雙側(cè)高斯空頻濾波器。(E)計(jì)算的歸-化t-小管調(diào)制圖M，-(F)計(jì)算的t-小管位置的二進(jìn)制圖(A)、(E)和(F)中的標(biāo)條代表10um。(B)、(C和(D)中的尺度條代表0.25um-1的空間頻率。

我們提出了OPM相對(duì)于在常規(guī)顯微鏡中直接檢測(cè)熒光信號(hào)的收集效率的測(cè)量，并表明在我們的設(shè)置中，OPM角度為35°時(shí)，其收集效率為21%。作為這種較低檢測(cè)效率的交換條件，OPM具有與所有光片顯微技術(shù)相關(guān)聯(lián)的優(yōu)點(diǎn)，即只有被成像的焦平面被照明，也就是說(shuō)，沒(méi)有平面外的光漂或光毒，也沒(méi)有圖像處理或移動(dòng)部件需要獲得光學(xué)切片圖像，使光學(xué)切片圖像能夠以成像攝像機(jī)的幀速率直接獲得。

通過(guò)新穎的OPM的使用，我們已經(jīng)能夠第一次定位的起源Ca2+波在3-D。我們對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙重染色，使其起源于肌細(xì)胞的t管結(jié)構(gòu)。在對(duì)少量HF細(xì)胞(n=5)的初步研究中，我們發(fā)現(xiàn)HF肌細(xì)胞中較大的波頻率不是來(lái)自異常的脫管區(qū)，而是來(lái)自保留t-管組織的區(qū)域�；鸹ㄒ脖话l(fā)現(xiàn)在高t-tubule組織的區(qū)域更頻繁，特別是在上皮層區(qū)�；鸹ǖ男螒B(tài)也因管旁區(qū)火花較大和較長(zhǎng)的區(qū)域而不同。需要進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)這些結(jié)果在一個(gè)更大的細(xì)胞的規(guī)定。

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​高速SCMOS斜面顯微鏡在心肌細(xì)胞鈣動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用

高速SCMOS斜面顯微鏡在心肌細(xì)胞鈣動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用