三光子激發(fā)技術(shù)在藍(lán)光熒光團(tuán)成像中的應(yīng)用

本論文核心內(nèi)容為演示一種同時利用雙光子和三光子激發(fā)的新型顯微成像技術(shù)，用于對細(xì)菌群落的固有熒光進(jìn)行深度、無標(biāo)記成像。研究團(tuán)隊通過超快鐿（Yb）光纖激光放大器，以單一波長（1040納米）激發(fā)樣品，實現(xiàn)了活體細(xì)菌群落的多色成像。三光子激發(fā)技術(shù)在藍(lán)光熒光團(tuán)成像中表現(xiàn)出色，能有效克服高散射樣品中的光散射和離焦光漂白問題，成像深度可達(dá)800微米以上，為微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能研究提供了非侵入性工具。

本論文的重要發(fā)現(xiàn)者為Alma Fernández、Anton Classen、Nityakalyani Josyula、James T. Florence、Alexei V. Sokolov、Marlan O. Scully、Paul Straight和Aart J. Verhoef。論文題為“Simultaneous Two- and Three-Photon Deep Imaging of Autofluorescence in Bacterial Communities”，發(fā)表在學(xué)術(shù)期刊《Sensors》。

重要發(fā)現(xiàn)
01實驗系統(tǒng)設(shè)計與成像原理
論文的核心貢獻(xiàn)在于開發(fā)了一套基于超快光纖激光器的多光子成像系統(tǒng)，用于對鏈霉菌（Streptomyces）細(xì)菌群落的固有熒光進(jìn)行深度成像。實驗系統(tǒng)采用自建的 monolithic Yb光纖激光器，其輸出波長為1040納米，脈沖持續(xù)時間約180飛秒，重復(fù)頻率可調(diào)（本實驗使用4.17兆赫茲），脈沖能量最高達(dá)400納焦耳。激光束通過光柵壓縮器補償色散后，由25倍、數(shù)值孔徑1.05的物鏡聚焦到樣品上，熒光信號通過非解掃描檢測方式收集，并分三個光譜通道：藍(lán)色（400-480納米，對應(yīng)三光子激發(fā)）、綠色（490-560納米，混合激發(fā)）和紅色（570-640納米，對應(yīng)雙光子激發(fā)）。該系統(tǒng)的關(guān)鍵優(yōu)勢在于單一光源即可同時激發(fā)雙光子和三光子過程，無需復(fù)雜的光參量放大裝置，降低了設(shè)備復(fù)雜度。

創(chuàng)新與亮點
01突破藍(lán)光熒光團(tuán)深層成像難題
論文首次解決了細(xì)菌群落中藍(lán)光區(qū)域固有熒光團(tuán)的深層成像挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡使用紫外或深藍(lán)光激發(fā)時，會遭遇強烈的組織散射和吸收，且易引起樣品光損傷。三光子激發(fā)通過長波長（1040納米）紅外光實現(xiàn)等效于紫外波段（約347納米）的激發(fā)，顯著降低散射損耗，使成像深度提升至傳統(tǒng)方法的5倍以上。這一突破使得研究人員無需對樣品進(jìn)行切片處理即可觀察細(xì)菌群落內(nèi)部結(jié)構(gòu)，為活體微生物研究提供了重要技術(shù)支撐。

總結(jié)與展望
本研究成功開發(fā)了基于超快光纖激光器的雙光子、三光子同步成像技術(shù)，實現(xiàn)了對細(xì)菌群落固有熒光的深度、無標(biāo)記觀測。通過系統(tǒng)驗證，三光子激發(fā)在藍(lán)光熒光團(tuán)成像中展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢，特別是在高散射樣品中能維持優(yōu)異信噪比，成像深度可達(dá)800微米。該技術(shù)為微生物群落結(jié)構(gòu)分析和代謝過程研究提供了強大工具。

未來研究方向包括進(jìn)一步提升成像速度以實現(xiàn)動態(tài)過程捕捉，拓展光譜檢測范圍以覆蓋更多內(nèi)源熒光團(tuán)，以及開發(fā)便攜式設(shè)備用于野外微生物樣本快速檢測。隨著激光技術(shù)的持續(xù)發(fā)展，多光子成像有望成為微生物學(xué)研究的標(biāo)準(zhǔn)手段，為環(huán)境微生物、醫(yī)學(xué)病原體和工業(yè)菌株等領(lǐng)域提供更深入的觀測能力。

DOI:10.3390/s24020667.