利用樹狀NIR-II花菁支持深度成像和精確手術
本文要點：高性能NIR-II熒光團（1000–1700 nm）的分子設計面臨水性穩(wěn)定性差、量子產率低及腫瘤對比度不足等關鍵挑戰(zhàn)。本研究通過共價整合親水性花菁核心（Cy-NIR-II-NH₂），構建代際可調的聚（L-賴氨酸）樹狀大分子（Cy-NIR-II-Gx）。該樹狀結構抑制H-聚集并隔離水相淬滅，實現(xiàn)24.3倍量子產率提升（水中達0.802%）及48小時光照后>83%的光穩(wěn)定性保留。這些突破支持深層組織穿透與高對比度血管/淋巴成像，在特定場景中超越臨床批準的吲哚菁綠（ICG）。進一步實驗表明：Cy-NIR-II-G8經皮內或靜脈給藥后，對皮下4T1乳腺腫瘤具有優(yōu)異靶向蓄積性——持續(xù)7天的瘤正比>5，滿足精準切除的臨床導航標準（羅斯判據(jù)），術中切緣勾勒明確，切除后信號近完全消除。此分子工程策略有效攻克NIR-II熒光團核心難題，展現(xiàn)重大臨床轉化潛力。
方案1. 用于深部生物成像應用的親水性NIR-II菁樹狀大分子（Cy-NIR II Gx）的設計和合成策略
本研究報道新型NIR-II花菁染料（Cy-NIR-II-NH₂）的理性設計與合成，其伯胺基團可增強水溶性并便于功能化修飾（方案1）。通過L-賴氨酸單體的迭代共價偶聯(lián)，構建了結構精準可控的代際可調聚賴氨酸樹狀大分子（Cy-NIR-II-Gx）。精準代際調控（G0至G8）有效抑制了Cy-NIR-II-NH₂在水相中的H-聚集，并通過樹狀外殼的剛性隔離效應顯著降低水分子碰撞導致的非輻射弛豫，同步提升溶解性、熒光亮度與光穩(wěn)定性。進一步在高分辨率血管成像及淋巴顯影中驗證其生物醫(yī)學價值，最終實現(xiàn)原位4T1乳腺腫瘤的熒光導航精準切除，術中切緣清晰勾勒。
圖1. 水溶性易改性NIR-II菁染料的合成與光物理表征
基于2-甲基苯并[cd]吲哚衍生物與聚次甲基橋鏈構建親水性D-π-A骨架，本研究設計出新型NIR-II花菁染料（圖1a）。以苯并[cd]吲哚-2(1H)-酮為起始物，通過格氏加成與克腦文格爾縮合等關鍵步驟高效合成，成功精準安裝雙伯胺基團——該步驟極具挑戰(zhàn)性（核心結構與末端官能團易降解）——從而增強水溶性并支持胺反應性連接臂修飾。
Cy-NIR-II-NH₂光物理表征顯示（圖1b）：980 nm激發(fā)下，DMSO中最大吸收峰≈990 nm（摩爾吸光系數(shù)ε=1.36×10⁵ M⁻¹ cm⁻¹），發(fā)射峰1044 nm且譜帶覆蓋1000-1350 nm（延伸至NIR-IIa區(qū)），證實NIR-II成像能力。相較于多數(shù)NIR-II染料水溶性差的問題，Cy-NIR-II-NH₂溶解性與臨床批準藥物ICG相當，優(yōu)于商用染料IR-26/IR-1048（圖1c,）；其水溶液在800 nm處出現(xiàn)強吸收峰，歸因于疏水苯并[cd]吲哚-聚次甲基骨架通過面對面堆疊形成H-聚集物——此為平面花菁染料水相特征行為。
通過TDDFT計算（B3LYP/6-31+G(d)水平）對比Cy-NIR-II-NH₂與ICG（二者結構相似）的原子排布影響（圖1d）：兩染料HOMO軌道均分布于苯環(huán)原子，能級相近；差異在于ICG的LUMO僅少量分布于苯并[e]吲哚環(huán)，而Cy-NIR-II-NH₂的LUMO離域于整個共軛鏈致能級顯著降低。更低的S0-S1激發(fā)能與更高重組能驗證其相對ICG的紅移趨勢，振子強度與高吸光系數(shù)吻合。Cy-NIR-II-NH₂輻射衰變速率較低導致量子產率（QY）弱于ICG，但理論證實兩染料S1激發(fā)均主要源于HOMO→LUMO躍遷——在LUMO主要分布的共軛聚次甲基鏈周圍構建隔離微環(huán)境，可有效阻斷水分子相互作用，減少非輻射能量轉移，從而提升水相熒光QY。
以IR-26（二氯乙烷中0.05%）為參照，測得Cy-NIR-II-NH₂熒光QY為0.033%（圖1e-g），與多數(shù)NIR-II納米材料相當，滿足活體成像需求。該染料集NIR-II光學特性、增強水溶性與易修飾性于一體，在NIR-II熒光成像及生物醫(yī)學應用中潛力顯著。
圖2. 樹狀Cy-NIRⅡ的合成及光物理性質
使Cy-NIR-II-NH₂與Boc保護賴氨酸五氟苯酯反應生成第一代樹狀前體，經Boc脫保護制得Cy-NIR-II-G1（圖2a）。通過賴氨酸偶聯(lián)（Boc-Lys(Boc)-OPFP）與脫保護循環(huán)迭代，逐級合成高階樹狀大分子（Cy-NIR-II-Gx），最終獲得第八代產物Cy-NIR-II-G8。所有結構經高分辨質譜/MALDI-TOF-MS及核磁嚴謹表征（圖2b），實驗值與理論預測高度吻合，證實各代結構完整性。HPLC分析顯示單一尖銳峰（圖2b），保留時間隨代際升高系統(tǒng)性縮短（G0:18.5分鐘→G8:10.4分鐘），歸因于累積表面氨基增強的分子極性——該單峰洗脫特征確證無結構缺陷及副產物，保障生物醫(yī)學應用可重復性。凝膠滲透色譜（GPC）進一步驗證單分散性：保留時間隨代際增加而降低（G4:16.5分鐘→G8:14.3分鐘），符合分子量增大導致的流體動力學半徑擴張；多分散指數(shù)（PDI=1.030–1.078）證實分子量分布均一。透射電鏡（TEM）顯示Cy-NIR-II-G8為單分散球形納米粒（直徑14.4±0.4 nm，高斯擬合，圖2d）；動態(tài)光散射（DLS）測得流體動力學直徑≈20 nm（圖S33），歸因于水化溶劑化效應。綜上，該NIR-II樹狀大分子具備結構精準、尺寸可調及優(yōu)異單分散性，彰顯其作為可重復性生物醫(yī)學制劑的顯著潛力。
隨后探究樹狀大分子在水溶液中的光學特性：隨著樹狀大分子生成量的增加，吸收最大值逐漸紅移從≈800 nm（G0）紅移至960 nm（G2）后趨于穩(wěn)定（圖2e），所有代際均保持≈10⁵ M⁻¹ cm⁻¹的高吸光系數(shù)。此紅移歸因于樹狀結構表面親水性增強削弱疏水作用，從而解離H-聚集體——代表一種抑制水相H-聚集的創(chuàng)新分子工程策略。熒光特性亦呈代際依賴性：隨代際升高，發(fā)射強度持續(xù)增強（圖2f），量子產率（QY）從0.033%（G0）提升至0.802%（G8），增幅達24.3倍（圖2g）。該QY值顯著超越IR-26等參照染料及水溶性NIR-II染料（如CH-1055-PEG），NIR-II成像下水溶液亮度增強直觀驗證此效應（圖2h）。
光穩(wěn)定性對生物醫(yī)學應用至關重要�；ㄝ既玖系木鄞渭谆鶚蜴溡资軉尉�態(tài)氧（¹O₂）介導的光氧化切割，而樹狀大分子的聚賴氨酸（PLL）封裝形成空間位阻屏蔽，阻斷染料核心與¹O₂接觸。短期激光照射下，Cy-NIR-II-G8溶液保持穩(wěn)定熒光強度與成像亮度（圖2i,j），性能優(yōu)于ICG；低代樹狀分子（G0-G2）亦展現(xiàn)微弱光降解。48小時可見光照射實驗進一步驗證：ICG降解率達87.2%，而Cy-NIR-II-G8僅降低17.8%（圖2k）。低代類似物因H-聚集體包埋熒光團限制¹O₂接觸而維持高穩(wěn)定性；高代樣品雖解聚削弱此效應，但PLL封裝通過空間排斥氧化物質實現(xiàn)補償。此雙機制協(xié)同作用（聚集保護與大分子屏蔽）印證了水相中樹狀結構的代際演化規(guī)律。
Cy-NIR-II-G8集高NIR-II熒光亮度、精準結構控制與卓越光穩(wěn)定性于一體，為破解NIR-II熒光團水相穩(wěn)定性與光學性能的固有矛盾提供了有效策略。
圖3. 模擬組織模型的深部組織穿透評估
熒光探針的組織穿透能力決定著活體成像效能。本研究利用NIR-II熒光長發(fā)射波長帶來的深層光子穿透優(yōu)勢，通過定制InGaAs相機系統(tǒng)在1%脂乳仿體中對Cy-NIR-II-Gx樹狀分子進行穿透深度定量評估（圖3a）。垂直浸入的含樹狀分子溶液毛細管經激光激發(fā)后，呈現(xiàn)代際依賴性穿透特征：基于低代樹狀分子的顯著H-聚集效應及G4代起量子產率（QY）的躍升（圖2g），選取G4-G8（980 nm激發(fā)）與吲哚菁綠（ICG，808 nm激發(fā)）對比分析。
隨著深度增加，所有熒光信號均衰減且毛細管輪廓模糊，但僅Cy-NIR-II-G8在6 mm深度仍呈現(xiàn)清晰邊緣（圖3b）。通過截面強度分布與高斯擬合定量，以信背比（SBR）>2.0且可分辨毛細管結構的最大深度定義為穿透深度：Cy-NIR-II-G8達6 mm，顯著優(yōu)于低代樹狀分子（4-5 mm）及ICG（3 mm）（圖3c）。在>4 mm深度，樹狀分子半高寬（FWHM）保持穩(wěn)定，而ICG從3 mm起顯著展寬（圖3d）。
熒光強度衰減曲線的指數(shù)擬合顯示，樹狀分子光學衰減系數(shù)（τ）隨代際升高系統(tǒng)性降低（G4:0.7955 → G8:0.5089），顯著低于ICG（0.8974）（圖3e）。此衰減減弱源于雙重機制：① 瑞利定律主導的光子散射減少——較長NIR-II發(fā)射波長（1000-1350 nm）最小化散射事件；② 代際依賴性QY提升增強信號補償，G8的高QY通過增加光子通量抵消傳播損耗。Cy-NIR-II-G8因此在納摩爾濃度下實現(xiàn)卓越組織穿透與高對比度成像，確立為深層組織NIR-II生物成像的理想探針。
圖4. 樹狀Cy-NIR-II分子 G8與ICG的NIR-II血管造影
近紅外熒光成像是心血管疾�。–VD）診療的關鍵技術，其深層組織分子可視化能力可靈敏檢測高風險動脈粥樣硬化斑塊成分（脂質、炎癥標志物）——這些結構成像（如CT/超聲）無法穿透血液散射揭示的特征，卻是心血管不良事件的核心預測因子。基于此，研究者評估了Cy-NIR-II-G8的活體空間分辨率：BALB/c裸鼠靜脈注射后實時NIR-II成像顯示（圖4a），5秒內熒光精準定位尾靜脈；10秒經靜脈回流至心腔；15秒頸動脈全身擴散；20秒部分肝蓄積；60秒完成全身血管高清成像。1分鐘內實現(xiàn)從局部靜脈到全身血管的快速可視化，滿足臨床快速診斷需求。
在腦、頸、腹、后肢四部位與ICG對比證實Cy-NIR-II-G8的血管成像優(yōu)勢（圖4b-e）：高斯擬合顯示其信背比（SBR=1.27-1.81）顯著高于ICG（1.12-1.51），半高寬（FWHM=0.367-0.664 mmvs ICG's 0.606–0.847 mm）更窄。即使在厚組織顱骨區(qū)域仍可分辨血管，而ICG因短波長散射嚴重且肝攝取快完全失效。Cy-NIR-II-G8注射后血管信號清晰維持超1小時，凸顯其長循環(huán)穩(wěn)定性。該探針僅需20 nmol劑量、0.2 W cm⁻²激光功率及≤100 ms曝光，即可在微創(chuàng)條件下實現(xiàn)高對比度血管成像。其卓越性能源于三大本質特性：快速全身分布與穩(wěn)定循環(huán)動力學、NIR-II窗口內散射抑制、高量子產率——這些協(xié)同效應使Cy-NIR-II-G8成為臨床實時影像導航介入治療的理想制劑。
圖5. 樹狀Cy-NIR II- G8的體內淋巴NIR-II成像和腫瘤蓄積
前哨淋巴結（SLN）檢測技術可實現(xiàn)選擇性切除，規(guī)避了為預防轉移進行全淋巴結清掃術引發(fā)的淋巴水腫等并發(fā)癥。當前SLN定位通常依賴放射性同位素和/或藍染料識別最可能轉移的淋巴結，但存在明顯局限：放射性同位素存在安全隱患，而藍染料在可見光窗口下組織穿透性差。近紅外（NIR）導航系統(tǒng)憑借更高淋巴結定位精度和更小切口，可優(yōu)化術中引導并加速術后恢復，但NIR-I光學成像仍面臨光漂白、組織自發(fā)熒光及探測深度不足的挑戰(zhàn)。
為評估Cy-NIR-II-G8的SLN成像性能并驗證NIR-II熒光團優(yōu)勢，在荷4T1腫瘤的BALB/c裸鼠雙側后爪皮內注射Cy-NIR-II-G8或吲哚菁綠（ICG）。熒光成像顯示：Cy-NIR-II-G8注射后2小時內即可清晰追蹤淋巴結間集合淋巴管、坐骨淋巴結及腘淋巴結（圖5a）；8小時后淋巴管信號減弱而淋巴結熒光持續(xù)，腫瘤區(qū)域出現(xiàn)蓄積；48小時腫瘤信號達峰值并維持至72小時（圖5c）。ICG雖可檢測淋巴結，但無法分辨淋巴管。橫向血管高斯分析證實Cy-NIR-II-G8憑借NIR-II窗口散射減弱，信背比（1.41 vs ICG 1.18）更高、半高寬（0.361 mm vs 0.619 mm）更窄（圖5b）。
Cy-NIR-II-G8通過皮內注射實現(xiàn)高對比度淋巴系統(tǒng)成像及長效腫瘤滯留，這歸因于其增強的NIR-II量子產率與光穩(wěn)定性。上述特性為長期觀測（如影像導航手術）提供了關鍵技術支撐。
圖6. 樹狀Cy-NIR II- G8的體內腫瘤聚集和NIR-II圖像引導手術
為評估Cy-NIR-II-G8在腫瘤長效監(jiān)測與精準切除導航中的整合效能，對4T1荷瘤小鼠靜脈注射該制劑并持續(xù)NIR-II熒光追蹤，最終實施影像引導腫瘤切除（圖6a）。樹狀分子經優(yōu)化的流體動力學直徑規(guī)避了腎快速清除，同時通過增強滲透滯留（EPR）效應及轉胞吞介導的腫瘤內滲實現(xiàn)納米粒靶向遞送（圖6b）。腫瘤熒光強度隨時間持續(xù)升高，注射48小時達峰值瘤正比（T/NT）>5，并維持超7天。該持續(xù)信號超越羅斯判據(jù)閾值（SBR=5），實現(xiàn)清晰切緣勾勒（圖6f）。
注射7天后，基于Cy-NIR-II-G8的強NIR-II信號實施影像導航切除：術中瘤-正常組織邊界分明（圖6d），切除后熒光降至肌組織本底水平（圖6e），定量分析顯示瘤正比從5.10降至1.13（圖6f）。注射48小時生物分布證實腫瘤特異性蓄積，脾肝僅見微弱信號（圖6g,h），瘤肝比>2.5。此靶向蓄積特性顯著區(qū)別于傳統(tǒng)NIR-II熒光團（主要富集于肝脾網狀內皮系統(tǒng)）。該研究確立Cy-NIR-II-G8為一體化納米平臺：憑借尺寸優(yōu)化的體內分布特性提供符合臨床導航標準的持續(xù)對比度，集腫瘤長效監(jiān)測與精準切除導航功能于一體。
本研究首次創(chuàng)造性構建了以近紅外二區(qū)花菁染料（Cy-NIR-II-NH₂）為核的聚L-賴氨酸樹狀大分子（Cy-NIR-II-Gx）。該設計在保留花菁染料本征NIR-II光學特性的同時，通過隔離水環(huán)境的干擾確保膠體穩(wěn)定性。代際生長賦予可編程光物理特性：樹狀枝接增強分子分散性，空間位阻屏蔽破壞H-聚集（吸收紅移至960nm），協(xié)同將熒光量子產率提升24.3倍（水中達0.802%）并實現(xiàn)卓越光穩(wěn)定性（48小時光照后信號保留>83%）。優(yōu)化后的Cy-NIR-II-G8兼具NIR-II發(fā)射與優(yōu)越腫瘤靶向蓄積能力，達成深層組織穿透（仿體6mm，兩倍于ICG）及亞0.4mm血管分辨率，支撐多功能生物成像：實時血流動力學追蹤、高對比度淋巴顯影、持續(xù)瘤正比>5長達7天的腫瘤長效監(jiān)測。其符合精準腫瘤切除的臨床導航標準（羅斯判據(jù)，SBR=5），經清晰切緣勾勒與切除后信號近完全消除驗證（瘤正比≈1.13）。該可編程樹狀拓撲結構以尺寸可調和表面氨基豐富為特征，支持定制化細胞內核化，并為靶向分子（如抗體、多肽）偶聯(lián)提供多功能位點，推進影像導航治療。此項工作通過融合NIR-II花菁光子學與樹狀納米技術，建立了突破NIR-II染料"溶解性-亮度-穩(wěn)定性"平衡困境的多功能診療平臺，連接術中導航與術后監(jiān)測，推動精準癌癥醫(yī)學發(fā)展。
參考文獻
He, Bo, et al. "Dendritic NIR‐II Cyanines Enable Deep Imaging and Precise Surgery." Small (2025): e09826.
⭐️ ⭐️ ⭐️
動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS
In Vivo Imaging System
高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優(yōu)于3um
熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us
高速采集 - 速度優(yōu)于1000fps （幀每秒）
多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴展X射線輻照、熒光壽命、光聲和光熱成像、原位成像光譜，CT等
顯微鏡 - 高分辨顯微成像系統(tǒng)，兼容成像型光譜儀
⭐️ ⭐️ ⭐️
恒光智影
上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司，被評為“國家高新技術企業(yè)”、“上海市專精特新中小企業(yè)”，獲國家科技部“重大科學儀器研發(fā)專項”支持，榮獲上海市“科技創(chuàng)新行動計劃”科學儀器項目、上海市2025年度關鍵技術研發(fā)計劃“計算生物學”項目。
恒光智影，致力于為生物醫(yī)學、臨床前和臨床應用等相關領域的研究提供先進的、一體化的成像解決方案。
專注動物活體成像技術，成像范圍覆蓋 400-1700 nm，同時可整合CT, X-ray，超聲，光聲，光熱成像等技術。
可為腫瘤藥理、神經藥理、心血管藥理、大分子藥代動力學等一系列學科的科研人員提供清晰的成像效果，為用戶提供前沿的生物醫(yī)藥與科學儀器服務。
