細(xì)胞核分離試劑盒在人類+小鼠snRNA-seq全景數(shù)據(jù)集生成中的應(yīng)用

期刊：Scientific Data
影響因子：6.9
通訊單位：浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院
伯豪技術(shù)產(chǎn)品：伯優(yōu)^®細(xì)胞核分離試劑盒

導(dǎo)語(yǔ)
足細(xì)胞（POD）損傷是腎小球疾病的標(biāo)志，也是蛋白尿和腎病綜合征的中心原因。盡管近年來(lái)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速，足細(xì)胞捕獲難度大、專屬單細(xì)胞數(shù)據(jù)集缺失，導(dǎo)致其損傷機(jī)制研究停滯不前，臨床治療仍依賴傳統(tǒng)激素和免疫抑制劑。如今，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)重磅研究，終于填補(bǔ)了這一空白。本研究收集5種PCP患者的腎臟組織，建立兩種POD損傷小鼠模型，進(jìn)行單核RNA測(cè)序（sn-RNA-seq）。成功地生成了人類和小鼠PCP的單細(xì)胞分辨率腎臟圖譜，并結(jié)合微量白蛋白尿相關(guān)基因組廣泛關(guān)聯(lián)研究（GWAS）數(shù)據(jù)集，確定了與POD損傷相關(guān)的潛在治療靶點(diǎn)。這些發(fā)現(xiàn)為今后對(duì)POD損傷分子機(jī)制的研究提供了寶貴的資源和堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

主要產(chǎn)品
sn-RNA-seq、伯優(yōu)^®細(xì)胞核分離試劑盒
（技術(shù)產(chǎn)品伯豪生物提供）

研究結(jié)果
1.人類患者與對(duì)照組腎小球的 H&E 染色圖 —— 直觀驗(yàn)證 “病理真實(shí)性”
圖 1 展示的是健康對(duì)照組和 5 類 PCP 患者（MCD、FSGS、DN、MN、OBN）腎小球的代表性 H&E 染色圖像（比例尺 50μm），核心作用是通過(guò)病理形態(tài)學(xué)證據(jù)，證明納入研究的患者樣本確實(shí)存在足細(xì)胞損傷相關(guān)的典型病變。

從圖中能清晰觀察到：對(duì)照組的腎小球結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞排列規(guī)則，濾過(guò)屏障形態(tài)正常；而 5 類 PCP 患者的腎小球均出現(xiàn)不同程度的異常 —— 比如足細(xì)胞足突融合（電子顯微鏡已佐證，H&E 染色可間接反映細(xì)胞形態(tài)紊亂）、腎小球系膜區(qū)增寬等。這些形態(tài)學(xué)差異直接呼應(yīng)了研究納入標(biāo)準(zhǔn)（所有患者均經(jīng)病理確診為足細(xì)胞�。�，說(shuō)明用于測(cè)序的人類樣本 “貨真價(jià)實(shí)”，不存在病理診斷偏差，為后續(xù)分析 “疾病狀態(tài)下的基因表達(dá)變化” 提供了可靠的樣本基礎(chǔ)。
 

圖1

圖 2A（ADRN 模型 UACR 柱狀圖）：UACR（尿白蛋白肌酐比）是反映腎臟濾過(guò)功能損傷的核心指標(biāo)。圖中清晰顯示，阿霉素誘導(dǎo)的 ADRN 模型小鼠，UACR 顯著高于生理鹽水對(duì)照組（P<0.001，n=5），說(shuō)明模型小鼠已出現(xiàn)明顯蛋白尿，足細(xì)胞濾過(guò)功能受損；圖 2B（ADRN 模型腎小球 H&E 染色圖）：比例尺 100μm，對(duì)比對(duì)照組，ADRN 模型小鼠的腎小球呈現(xiàn) “顯著腎小球硬化”—— 腎小球結(jié)構(gòu)塌陷、纖維化程度升高，這與人類 FSGS 等足細(xì)胞病的病理特征高度相似，證明模型能模擬 “足細(xì)胞損傷→腎小球硬化” 的病理進(jìn)程；

圖 2C（OBN 模型 UACR 柱狀圖）：與正常飲食對(duì)照組相比，高脂飲食誘導(dǎo)的 OBN 模型小鼠，UACR 同樣顯著升高（P<0.001，n=5），表明肥胖介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷已導(dǎo)致濾過(guò)功能異常；圖 2D（OBN 模型腎小球 H&E 染色圖）：比例尺 100μm，OBN 模型小鼠的腎小球呈現(xiàn) “明顯腎小球肥大”—— 這是肥胖相關(guān)腎病的典型病理表現(xiàn)，與人類 OBN 患者的腎小球形態(tài)特征一致，證明該模型能精準(zhǔn)模擬代謝因素導(dǎo)致的足細(xì)胞損傷。

簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，圖 2 的核心價(jià)值是 “驗(yàn)證模型有用”：只有證明小鼠模型確實(shí)出現(xiàn)了足細(xì)胞損傷相關(guān)的功能異常（UACR 升高）和病理改變（硬化 / 肥大），后續(xù)對(duì)小鼠腎臟組織的 snRNA-seq 分析才有意義 —— 才能通過(guò)小鼠數(shù)據(jù)與人類數(shù)據(jù)的對(duì)比，交叉驗(yàn)證足細(xì)胞損傷的分子機(jī)制。

圖2

2.跨物種 + 多維度設(shè)計(jì)，打造足細(xì)胞病研究 “黃金數(shù)據(jù)集”
在樣本覆蓋上，研究同時(shí)納入了人類患者與小鼠模型，全面覆蓋 5 類核心足細(xì)胞病。人類樣本方面，團(tuán)隊(duì)收集了 2021-2025 年間邵逸夫醫(yī)院確診的 5 類 PCP 患者腎活檢組織，每類疾病各 3 例，這些患者均經(jīng)資深腎病理學(xué)家和臨床腎病學(xué)家依據(jù) KDIGO 指南，結(jié)合病理特征、臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查確診，且活檢前未接受過(guò)激素或免疫抑制劑治療，腎功能保持良好（腎小球?yàn)V過(guò)率 eGFR＞90 mL/min/1.73m²），電子顯微鏡檢查均顯示存在明顯的足細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為廣泛的足突融合和丟失，部分患者 24 小時(shí)尿蛋白量最高達(dá) 12.3g（如 MCD-3 患者），充分體現(xiàn)了疾病的典型性；同時(shí)，團(tuán)隊(duì)還納入了 3 例因腎細(xì)胞癌接受單側(cè)腎切除患者的正常腎組織作為健康對(duì)照，對(duì)照者臨床指標(biāo)穩(wěn)定，如 Control-1 患者年齡 23 歲，eGFR 達(dá) 115.4 mL/min/1.73m²，為研究提供了可靠的基線參考。小鼠模型方面，團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了兩種經(jīng)典的足細(xì)胞損傷模型：給 8 周齡 Balb/c 小鼠尾靜脈單次注射 9mg/kg 阿霉素（ADRN 模型），6 周后安樂(lè)死取組織；給 8 周齡 C57BL/6J 小鼠喂食 60% 高脂飲食（Research Diets D12492）16 周構(gòu)建肥胖介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型（OBN 模型），每組均設(shè)置生理鹽水注射或正常飲食的對(duì)照小組，最終每組隨機(jī)選取 3 只小鼠用于后續(xù)測(cè)序。

本研究的整體數(shù)據(jù)處理與驗(yàn)證流程如圖 3 所示。在文庫(kù)構(gòu)建階段，通過(guò) Agilent 2100 生物分析儀對(duì)每個(gè)樣本的 cDNA 片段大小分布進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示所有樣本均呈現(xiàn)清晰的單峰，平均片段長(zhǎng)度約為 1400 bp（人類樣本峰值范圍 1356-1549 bp，小鼠樣本峰值范圍 1352-1580 bp），表明 RNA 完整性得到良好保留，所構(gòu)建的文庫(kù)質(zhì)量完全符合測(cè)序要求。數(shù)據(jù)處理過(guò)程中，采用嚴(yán)格的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)篩選有效細(xì)胞核：剔除 UMI 計(jì)數(shù)＞5000 或＜200 的細(xì)胞核，同時(shí)排除線粒體基因占比＞5% 的細(xì)胞核，以去除低質(zhì)量細(xì)胞、環(huán)境污染物及嵌合 reads。經(jīng)篩選后，人類樣本共獲得 160511 個(gè)高質(zhì)量細(xì)胞核，小鼠樣本共獲得 89743 個(gè)高質(zhì)量細(xì)胞核，后續(xù)通過(guò) scVI 包去除批次效應(yīng)，采用 Leiden 算法進(jìn)行細(xì)胞聚類，結(jié)合已知細(xì)胞類型標(biāo)志物最終完成細(xì)胞注釋。
 

 
圖3

3.解鎖足細(xì)胞損傷的分子密碼
從小鼠數(shù)據(jù)集中成功提取出 818 個(gè)足細(xì)胞（POD），并進(jìn)一步將其細(xì)分為健康足細(xì)胞（hPOD）和損傷足細(xì)胞（iPOD）兩個(gè)亞群（圖 5D）；對(duì)比對(duì)照組，阿霉素誘導(dǎo)損傷模型（ADRN）和肥胖介導(dǎo)損傷模型（OBN）小鼠的健康足細(xì)胞（hPOD）數(shù)量均顯著減少，而損傷足細(xì)胞（iPOD）數(shù)量明顯增加（圖 5E），這一結(jié)果與病理表型一致，驗(yàn)證了細(xì)胞亞群分類的可靠性。

隨后，通過(guò)將人類 snRNA-seq 數(shù)據(jù)與多族群微量白蛋白尿（MA）全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）結(jié)果整合，在足細(xì)胞中鑒定出 92 個(gè)與微量白蛋白尿存在潛在遺傳關(guān)聯(lián)的基因（圖 6A）。進(jìn)一步對(duì)人類和小鼠的健康足細(xì)胞（hPOD）與損傷足細(xì)胞（iPOD）進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，結(jié)果顯示：人類健康足細(xì)胞中 3677 個(gè)基因顯著上調(diào)，8419 個(gè)基因顯著下調(diào)（圖 6B）；小鼠健康足細(xì)胞相較于損傷足細(xì)胞，有 3813 個(gè)基因上調(diào)，7837 個(gè)基因下調(diào)（圖 6C），差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為校正后 P 值（FDR）＜0.05 且絕對(duì)對(duì)數(shù)倍變化（|log2FC|）≥0.25。

通過(guò)將差異表達(dá)基因與潛在遺傳關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行交集分析，最終篩選出 16 個(gè)核心基因（圖 6D）。除 CTSA 基因外，其余 15 個(gè)核心基因均在健康足細(xì)胞（hPOD）中呈現(xiàn)更高的表達(dá)水平（圖 6E-F）。

綜上，上述一系列技術(shù)驗(yàn)證步驟充分證實(shí)，本研究生成的數(shù)據(jù)集質(zhì)量?jī)?yōu)異，可用于后續(xù)下游分析與比較研究的二次利用，為相關(guān)領(lǐng)域的科研探索提供了可靠的數(shù)據(jù)支撐。

圖4

圖 5

圖 6

結(jié)語(yǔ)
該研究通過(guò)創(chuàng)新性整合單細(xì)胞核 RNA 測(cè)序（snRNA-seq）技術(shù)與微量白蛋白尿全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS），結(jié)合人類 5 類足細(xì)胞�。≒CP）臨床樣本與兩種小鼠足細(xì)胞損傷模型的跨物種設(shè)計(jì)，有效解決了足細(xì)胞（POD）捕獲效率低、專屬單細(xì)胞數(shù)據(jù)集缺失的長(zhǎng)期科研瓶頸。技術(shù)層面，依托Shbio Nucleus Isolation Kit的高效細(xì)胞核分離能力、10X Genomics Chromium 系統(tǒng)的精準(zhǔn)文庫(kù)構(gòu)建及Illumina 測(cè)序平臺(tái)的高保真測(cè)序，成功獲得了高質(zhì)量跨物種腎臟單細(xì)胞圖譜，鑒定出 20 余種腎臟細(xì)胞類型及足細(xì)胞 “健康 - 損傷”（hPOD/iPOD）特異性亞群，為細(xì)胞異質(zhì)性分析提供了可靠技術(shù)支撐；科學(xué)意義上，該研究不僅首次系統(tǒng)揭示了足細(xì)胞損傷的分子特征與疾病進(jìn)展規(guī)律，更通過(guò)多維度數(shù)據(jù)交集篩選出 16 個(gè)足細(xì)胞損傷相關(guān)核心靶點(diǎn)，填補(bǔ)了 PCP 領(lǐng)域單細(xì)胞水平機(jī)制研究的空白；同時(shí)，研究公開共享的原始數(shù)據(jù)、處理后數(shù)據(jù)集及分析代碼，為全球科研人員開展 PCP 分子機(jī)制探索、靶向藥物研發(fā)提供了寶貴的公共資源，其技術(shù)范式與研究思路也為其他難治性腎臟疾病的單細(xì)胞研究提供了重要借鑒，有力推動(dòng)了腎臟精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展進(jìn)程。

參考文獻(xiàn)：
Qing J, Hu J, Wang X, Wu J. Comprehensive snRNA-Seq Datasets of Human and Mouse Podocytopathy Integrated with GWAS of Microalbuminuria. Sci Data. 2025 Dec 16. doi: 10.1038/s41597-025-06427-1. Epub ahead of print. PMID: 41402390.

本產(chǎn)品專為從動(dòng)物組織中分離高純度的單細(xì)胞核而設(shè)計(jì)。組織通過(guò)勻漿、裂解細(xì)胞膜等步驟釋放完整細(xì)胞核，同時(shí)維持核膜穩(wěn)定性及染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，優(yōu)化的密度梯度離心或離心管柱技術(shù)可進(jìn)一步去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，從而可滿足下游單細(xì)胞組學(xué)、表觀遺傳學(xué)等前沿研究領(lǐng)域?qū)��?xì)胞核的質(zhì)量要求。本產(chǎn)品突破傳統(tǒng)解離法對(duì)樣本活性的依賴，廣泛適用于新鮮或新鮮冰凍組織，并兼容微量組織（<10 mg）；全流程操作簡(jiǎn)捷，為復(fù)雜樣本提供標(biāo)準(zhǔn)化的解決方案。