高光穩(wěn)定性重氮氧三茂染料的無背景熒光衰減時間傳感和pH成像
（論文部分內(nèi)容摘抄）
新型熒光重氮惡唑烷胺(DAOTA)pH基于壽命的自參考pH傳感的指標的報告。DAOTA染料被酚受體基團修飾，通過光致電子轉(zhuǎn)移機制誘導熒光猝滅。吸電子氯取代物確保在最相關(guān)的pH范圍內(nèi)(p，p-二氯苯酚和p-氯苯酚取代染料的表觀pK'a值分別為5和7.5)的應。熒光壽命長(17-20ns)，量子產(chǎn)率高(60%)，光穩(wěn)定性好。將染料固定到聚氨酯水凝膠D4中制備平面光催化劑。除了熒光強度的響應外，該光學元件還表現(xiàn)出pH依賴的壽命行為，這使其適合于借助熒光壽命成像技術(shù)研究二維pH分布。對于具有高染料濃度(0.5-1%wt.)的傳感器，壽命響應尤其明顯。相對于聚合物)，并歸因于高效的均FRET機制。
許多生物和生態(tài)系統(tǒng)是建立在廣泛的不同參數(shù)之間的微妙平衡基礎(chǔ)上的。其中最重要的是pH值，它在生物學、生物技術(shù)、醫(yī)學、海洋學和環(huán)境監(jiān)測等極其重要。為了監(jiān)測這些地區(qū)的pH值，熒光化學傳感器被證明是很有前途的分析工具，因為它們不受電磁干擾，能夠進行無創(chuàng)測量，并且有各種形式可供選擇，從平面光學傳感器和光纖傳感器到納米顆粒。與其他方法(例如電化學傳感)相比，光學傳感器能夠?qū)H進行成像表面上的分布(借助平面光管)或體積上的分布(借助納米顆粒)。特別是，平面光管已被應用于海洋沉積物pH梯度成像，2.3根際，45生物膜，6傷口8號和微流控芯片。
圖為新型pH敏感DAOTA染料的合成及傳感機理的指示劑方案。
FD-FLIM 成像：
用德國PCO的pco.flim相機在頻域內(nèi)工作，進行了成像實驗。激光源488nm的半導體激光器(PhoxXplus 488-200的pco.flim)，被調(diào)制在15 MHz的調(diào)制頻率(方波調(diào)制)。平均激光功率為100毫瓦。使用尼康公司的顯微鏡軟件進行數(shù)據(jù)采集和處理。為了進行微觀測量，將直徑為5毫米的傳感器點從傳感器箔上切下來，并粘在黑色96微孔板上。 圖像獲得與尼康顯微鏡配備一個尼康的目鏡和0.7x相機適配器安裝在相機上。該濾光立方體包括激勵帶通濾光器、二色鏡和發(fā)射長通濾光片。使用染料摻雜板作為壽命標準(t=3.75 ns)。為了進行宏觀測量，傳感器箔用環(huán)氧膠固定在開放式微流控芯片聚合物的通道中。
圖為PhOHCl2-DAOTA的平面光器件在D4(1%重量)中的pH的FLIM成像。
(b)：具有集成傳感器箔微流體芯片圖像；
(c)和(d)：對于同時用pH6.5和5.0的緩沖液沖洗的微流控芯片，分別產(chǎn)生衰減時間和pH分布的虛假彩色圖像;速度最小21毫升。
這項工作中，我們提出了新的熒光pH指示劑的合成和表征的基礎(chǔ)上重氮氧三棱柱染料。染料被合理地設(shè)計為既具有pH敏感性非共價固定到水凝膠基質(zhì)中的功能性和疏水性錨定基團和納米顆粒。染料在光譜的綠橙色部分具有吸收和發(fā)射的特征。且具有優(yōu)異光穩(wěn)定性。重要的是，pH指示劑保留極長的熒光衰減時間能夠在時間分辨測量中有效地消除自發(fā)熒光。
氯化酚被證明是優(yōu)良的受體，它能夠通過光誘導電子轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)pH值。以單氯化和二氯化部分裝飾的染料具有大不相同的pK'a值，因此使?jié)撛趹镁哂懈咄ㄓ眯浴３龊跻饬系氖�，我們發(fā)現(xiàn)固定在聚氨酯水凝膠和聚合物納米顆粒中的指示劑的熒光衰減時間與pH有很強的依賴性。這種行為依賴于濃度，而且在溶解指標中沒有觀察到，這被歸因于同性戀FRET。壽命測量的自參考特性使得新材料在 pH傳感和成像方面特別有吸引力。
德國Excelitas PCO公司pco.flim型號相機，具備高分辨率、高感光度、弱光成像的優(yōu)點，將顯微研究實驗過程完美記錄，為實驗提供強而有力的圖像數(shù)據(jù)支持。
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