DNA甲基化測序等研究揭示MSS結(jié)直腸癌PD-1聯(lián)合用藥治療新選擇

近日，廣東省人民醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心楊魏教授團隊聚焦于微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）型結(jié)直腸癌（約占高達95%轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（CRC）但PD-1免疫治療不敏感），探索了甲硫氨酸（Methionine）代謝通過表觀遺傳機制調(diào)控其免疫代謝檢查點PCSK9表達的分子機制，并系統(tǒng)驗證靶向干預(yù)該軸從而增強PD-1阻斷治療的轉(zhuǎn)化潛力。相關(guān)研究成果以“Methionine Metabolism Dictates PCSK9 Expression and Antitumor Potency of PD-1 Blockade in MSS Colorectal Cancer”為題發(fā)表于《Advanced Science》。

研究證實，腫瘤細胞內(nèi)甲硫氨酸經(jīng)MAT2A催化轉(zhuǎn)化為S-腺苷甲硫氨酸（SAM），并作為甲基供體激活DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）介導(dǎo)的甲基化，特異性抑制SIRT6表達，從而消除對PCSK9的轉(zhuǎn)錄抑制，導(dǎo)致PCSK9在腫瘤細胞中異常高表達，而高表達PCSK9通過降解MHC I、影響T細胞膽固醇代謝和TCR信號等多種通路共同抑制CD8+T細胞的抗腫瘤效應(yīng)。有趣的是，在 proficient錯配修復(fù)（pMMR）/微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）結(jié)直腸癌Colon 26荷瘤小鼠模型（抗PD-1治療應(yīng)答有限）中，通過飲食限制甲硫氨酸（DMR）或PCSK9抑制劑（alirocumab）能增強抗PD-1治療效果并促進CD8+ T細胞浸潤。此外，將PCSK9抑制與PD-1阻斷及標準化療藥物5-氟尿嘧啶（5-FU） 聯(lián)用，能產(chǎn)生更強的協(xié)同抗腫瘤效果。

研究通過整合RRBS與Target-BS等分析描繪了代謝-表觀遺傳-免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，建立了腫瘤微環(huán)境中氨基酸代謝（甲硫氨酸）與膽固醇代謝（PCSK9）之間的機制關(guān)聯(lián)，即腫瘤細胞通過感知甲硫氨酸調(diào)控PCSK9表達，揭示了MSS結(jié)直腸癌患者更大獲益的聯(lián)合治療新策略。

英文標題：Methionine Metabolism Dictates PCSK9 Expression and Antitumor Potency of PD-1 Blockade in MSS Colorectal Cancer
中文標題：甲硫氨酸代謝決定PCSK9表達及PD-1阻斷在MSS結(jié)直腸癌中的抗腫瘤效應(yīng)
發(fā)表時間：2025-3-24
發(fā)表期刊：Advanced Science
影響因子：IF14.1/Q1
技術(shù)平臺：RRBS、Target-BS等
作者單位：南方醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省人民醫(yī)院
DOI:10.1002/advs.202501623

圖形摘要：腫瘤細胞中甲硫氨酸代謝對PCSK9表達調(diào)控作用示意圖。

甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為SAM，通過DNMT1介導(dǎo)的DNA甲基化促進PCSK9轉(zhuǎn)錄并抑制SIRT6表達，從而導(dǎo)致PCSK9異常高表達及腫瘤免疫治療耐藥。

研究方法
（1）細胞模型：人源（SW480, SW620, HCT116, LoVo）和小鼠源（MC38, Colon 26）結(jié)直腸癌細胞系
（2）動物模型：構(gòu)建MSS型CRC的小鼠同系腫瘤模型（MC38, Colon 26）
（3）基因敲除：利用shRNA/siRNA敲低和CRISPR-Cas9敲除技術(shù)研究特定基因（如PCSK9, MAT2A, DNMT1, SIRT6）的功能。
（4）生物學(xué)檢測：

• 報告基因檢測：構(gòu)建PCSK9啟動子熒光素酶報告系統(tǒng)，檢測轉(zhuǎn)錄活性
• 蛋白質(zhì)與mRNA分析：Western Blot、qRT-PCR、ELISA等檢測蛋白和mRNA表達

（5）表觀遺傳學(xué)核心技術(shù)（RRBS與Target-BS）：

• RRBS：檢測和比較甲硫氨酸處理前后腫瘤細胞（SW480）的DNA甲基化模式變化，發(fā)現(xiàn)甲基化水平整體升高，并鑒定出SIRT6和FOXO3基因甲基化增加。
• Target-BS：靶向RRBS提示或機制假設(shè)相關(guān)的特定基因區(qū)域進行高深度甲基化水平檢測，驗證甲硫氨酸處理后PCSK9 genebody區(qū)甲基化增加。

（6）免疫學(xué)分析：

• 流式細胞術(shù)：分析腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）中CD8+T細胞的數(shù)目、表型（PD-1, TIM3, Ly108, TCF1）和功能（IFN-γ, Granzyme B）。
• 免疫組化：檢測腫瘤組織中PCSK9蛋白和CD8+ T細胞的浸潤情況。
• 體內(nèi)細胞耗竭：使用抗CD8抗體在體內(nèi)耗竭CD8+ T細胞，驗證其在該療法中的必要性。

（7）干預(yù)處理：

• 代謝干預(yù)：特定氨基酸缺失培養(yǎng)基、代謝物（SAM, SAH）補充、DNA甲基化抑制劑干預(yù)。
• 飲食干預(yù)：給荷瘤小鼠喂食正常飲食（0.86%甲硫氨酸）或甲硫氨酸限制飲食（0.12%甲硫氨酸）。
• 藥物干預(yù)：腹腔注射抗PD-1抗體、PCSK9中和抗體（阿利西尤單抗）、化療藥5-FU或其組合。

圖1：甲硫氨酸缺失會抑制體內(nèi)PCSK9表達。

（2）甲硫氨酸促進PCSK9 mRNA轉(zhuǎn)錄
為揭示調(diào)控層級，研究團隊轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析揭示了甲硫氨酸補充顯著升高SW480/SW620細胞PCSK9 mRNA水平（圖2A-B）。放線菌素D阻斷實驗表明，甲硫氨酸不改變PCSK9 mRNA穩(wěn)定性（圖2C-D），但轉(zhuǎn)錄抑制劑可完全消除其誘導(dǎo)效應(yīng)（圖2E），證實調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄起始階段。通過構(gòu)建-900 bp至-1 bp的PCSK9啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒，證實甲硫氨酸與SAM顯著增強啟動子活性（圖2F-G）。上述研究結(jié)果揭示了甲硫氨酸通過激活轉(zhuǎn)錄而非穩(wěn)定mRNA或蛋白來上調(diào)PCSK9。
 

圖2：甲硫氨酸促進PCSK9 mRNA轉(zhuǎn)錄。

（3）甲硫氨酸被分解代謝為SAM以促進PCSK9表達
甲硫氨酸進入細胞后的關(guān)鍵代謝通路是轉(zhuǎn)化為通用甲基供體SAM。研究團隊對TCGA數(shù)據(jù)庫的分析顯示，在CRC腫瘤組織中，催化SAM合成的限速酶MAT2A的表達與PCSK9的表達呈顯著正相關(guān)（圖3A-B）。功能實驗證實，直接補充SAM可以模擬甲硫氨酸的效果，增強PCSK9啟動子活性和mRNA表達（圖3C-D）。在甲硫氨酸剝奪的培養(yǎng)基中，補充SAM（而非其下游產(chǎn)物SAH）可以恢復(fù)PCSK9的表達（圖3E-F）。而敲低MAT2A或用其抑制劑AG-270處理，能阻斷甲硫氨酸（但不能阻斷SAM）對PCSK9的上調(diào)作用（圖3G-J）。同樣，放線菌素D也能阻斷SAM誘導(dǎo)的PCSK9上調(diào)（圖3K）。這些證據(jù)鏈清晰地表明，甲硫氨酸需要通過MAT2A催化轉(zhuǎn)化為SAM，進而促進PCSK9的轉(zhuǎn)錄。

圖3：甲硫氨酸被分解代謝為SAM以促進PCSK9表達

（4）DNMT1介導(dǎo)甲基化促進PCSK9 mRNA轉(zhuǎn)錄
SAM是DNA甲基化的主要甲基供體。研究團隊發(fā)現(xiàn)，使用DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞苷處理可以抑制甲硫氨酸和SAM對PCSK9啟動子活性、mRNA和蛋白水平的促進作用（圖4A-F）。在多種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶中，DNMT1（負責維持甲基化）在CRC腫瘤組織中高表達，且與PCSK9表達強相關(guān)（圖4G-H）。敲低DNMT1能顯著抑制甲硫氨酸或SAM對PCSK9表達的誘導(dǎo)作用（圖4I-L）。這些結(jié)果證明，甲硫氨酸/SAM通過DNMT1介導(dǎo)的DNA甲基化通路來促進PCSK9轉(zhuǎn)錄。

圖4：DNMT1介導(dǎo)的甲基化促進PCSK9 mRNA轉(zhuǎn)錄

（5）甲硫氨酸通過DNA甲基化抑制SIRT6以促進PCSK9 mRNA轉(zhuǎn)錄
為鑒定出受甲硫氨酸/SAM/DNMT1甲基化通路調(diào)控及影響PCSK9轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子，研究者對甲硫氨酸處理前后的SW480細胞進行了RRBS分析。結(jié)果顯示，甲硫氨酸補充普遍提高了大多數(shù)基因在不同區(qū)域的甲基化水平（圖5A-B）。研究人員特別關(guān)注抑制PCSK9轉(zhuǎn)錄的因子SIRT6及其轉(zhuǎn)錄激活因子FOXO3。RRBS和后續(xù)驗證發(fā)現(xiàn)，甲硫氨酸處理增加了SIRT6和FOXO3基因區(qū)域的DNA甲基化（圖6A-B），并導(dǎo)致SIRT6（而非FOXO3）的蛋白和mRNA水平下降（圖6C-F）。使用5-氮雜胞苷可以逆轉(zhuǎn)甲硫氨酸對SIRT6 mRNA的抑制（圖6G）。功能實驗表明，過表達SIRT6能部分阻斷甲硫氨酸對PCSK9上調(diào)（圖6H），而敲低SIRT6則能增強這種上調(diào)作用（圖6I-J）。

有趣的是，雖然甲硫氨酸能上調(diào)PCSK9，但Target-BS分析顯示PCSK9啟動子區(qū)域甲基化水平并無變化（圖5C-D），而其基因體區(qū)域甲基化水平升高（圖5E-F），提示基因體甲基化可能參與表達調(diào)控。

RRBS在上述研究結(jié)果中起到了整體篩查關(guān)鍵靶基因甲基化的作用，而Target-BS則用于對候選基因（SIRT6, FOXO3）和目的基因（PCSK9）的特定區(qū)域進行精準驗證和定量。

圖5：甲硫氨酸處理下SW480細胞的DNA甲基化圖譜

A. SW480細胞經(jīng)6小時甲硫氨酸剝奪后，再補充甲硫氨酸6小時的甲基化圖譜。
B. 甲硫氨酸缺失組與補充組不同基因組區(qū)域平均甲基化水平的比較。
C. 人類PCSK9假定啟動子區(qū)域GpC百分比的示意圖。
D. 通過Target-BS獲得的PCSK9啟動子區(qū)域甲基化圖譜。
E-F. 通過簡化基因組亞硫酸鹽測序（RRBS）獲得的PCSK9基因體區(qū)域甲基化水平。

圖6：甲硫氨酸通過DNA甲基化抑制SIRT6，進而促進PCSK9 mRNA轉(zhuǎn)錄

（6）飲食甲硫氨酸限制增強PD-1阻斷療法對MSS結(jié)直腸癌的療效
在機制明確的基礎(chǔ)上，研究進入臨床前治療驗證。在對抗PD-1治療原發(fā)耐藥的MSS Colon 26荷瘤小鼠模型中，單獨使用抗PD-1抗體或DMR均有一定抑瘤效果，但兩者聯(lián)合治療產(chǎn)生了顯著的協(xié)同作用，極大地抑制了腫瘤生長（圖6A-D）。免疫分析顯示，DMR能促進腫瘤內(nèi)CD8+ T細胞浸潤，與抗PD-1聯(lián)用后效果更強（圖6E-G），且改善T細胞效應(yīng)功能（圖6H）。更重要的是，當使用抗體耗竭體內(nèi)的CD8+ T細胞后，DMR的抗腫瘤效果完全消失（圖6I-J），證明DMR的療效完全依賴于CD8+ T細胞。上述研究結(jié)果為通過飲食干預(yù)改善免疫治療提供了直接證據(jù)。

圖7：飲食甲硫氨酸限制能增強PD-1阻斷MSS CRC的治療效果

（7）PCSK9抑制可增強PD-1治療和5-FU化療對MSS結(jié)直腸癌的療效
考慮到長期嚴格的飲食限制在臨床實踐中較難實施，研究者探索了更可行的藥物靶向策略。使用臨床已批準的PCSK9單抗阿利西尤單抗。在Colon 26模型中，單獨抑制PCSK9或抗PD-1效果有限，但兩者聯(lián)合治療能顯著抑制腫瘤生長，并增加腫瘤內(nèi)CD8+ T細胞浸潤（圖7A-D）。進一步考慮到5-FU是CRC標準一線化療，團隊設(shè)計了三聯(lián)方案：PCSK9抑制 + PD-1阻斷 + 5-FU化療。結(jié)果顯示，三聯(lián)療法相比任何雙藥組合或單藥，進一步降低腫瘤負荷（圖7E-H）。

上述研究這些結(jié)果提出了兩種極具轉(zhuǎn)化潛力的聯(lián)合治療方案：PCSK9抑制+PD-1免疫治療二聯(lián)方案、PCSK9抑制+PD-1免疫治療+5-FU化療三聯(lián)方案，為MSS CRC患者提供精準治療新選擇。

圖8：PCSK9抑制增強了PD-1阻斷治療和5-FU化療對MSS CRC的效果

結(jié)論和啟示
本研究首次揭示了腫瘤細胞利用甲硫氨酸的代謝產(chǎn)物SAM，通過DNMT1介導(dǎo)的甲基化，特異性地上調(diào)PCSK9，從而在MSS型CRC中建立了一個獨特的免疫抑制微環(huán)境。PCSK9作為一個新興的“免疫代謝檢查點”，在多個層面損害抗腫瘤免疫。本研究提出的聯(lián)合策略（靶向PCSK9或限制其上游甲硫氨酸），為克服MSS型CRC的免疫治療耐藥提供了新思路。

參考文獻：
Wang QL, Chen Z, Lu X, Lin H, Feng H, Weng N, Chen L, Liu M, Long L, Huang L, Deng Y, Zheng K, Zheng X, Li Y, Cai T, Zheng J, Yang W. Methionine Metabolism Dictates PCSK9 Expression and Antitumor Potency of PD-1 Blockade in MSS Colorectal Cancer. Adv Sci (Weinh). 2025 Mar 24:e2501623. doi: 10.1002/advs.202501623.