CD11b/Anti-F4/80/Monocyte巨噬細胞磁珠分選實驗流程及步驟
巨噬細胞（Macrophage）是由骨髓來源的單核細胞遷移至組織后分化形成的免疫細胞，廣泛分布于全身組織中。該細胞具有高度可塑性，可在特定信號刺激下，分化為參與炎癥清除的 M1 型或負責修復調節(jié)的 M2 型，是連接免疫防御與組織穩(wěn)態(tài)的核心細胞之一[1]。
巨噬細胞的分化與活化路徑圖[2]
巨噬細胞分選是相關研究中的關鍵環(huán)節(jié)，在磁珠分選實驗中有很多不可忽視的關鍵點，直接影響著分選實驗的得率和純度。本文將詳細解析美天旎磁珠分選實驗前后的關鍵注意事項，并深入解讀三款熱門巨噬細胞磁珠分選實驗流程（CD11b、Anti-F4/80、Monocyte），涉及陽性分選，陰性分選策略。助您一站式掌握巨噬細胞磁珠分選核心技術！
之前小優(yōu)也給大家介紹了CD3/CD4/CD8/Treg細胞、CD19/CD138/Pan B/B細胞、CD56/NK 細胞、CD14/Pan Monocyte DC細胞、CD45/CD8 腫瘤細胞磁珠分選保姆級protocol，小伙伴們按需查看呦~
關于磁珠分選實驗，您務必要知道的關鍵點（耐心看完，后附分選實操案例）
分選前準備
❖確認磁珠：
根據(jù)您的實驗種屬、樣本來源、目的細胞marker選擇適配的磁珠。
❖確認分選策略：
根據(jù)您實驗的指標類型以及后續(xù)需求選擇對應的分選策略。
陽性分選
目的細胞被磁性標記后，作為陽性標記組分直接分選出來。該方法常用于以下情況：
1.分選表達單一表面標志物的細胞分選（如CD3+,CD4+,CD8+細胞）
2.稀有細胞的分選 (如循環(huán)腫瘤細胞CTC、腫瘤浸潤淋巴細胞TIL)
3.表達較弱的表面標志物細胞分選（如CD133+細胞）
4.去除特定細胞群分選（如TCRαβ+T去除、CD45RA+細胞去除）
陰性分選/去除分選
非目的細胞磁性標記后從細胞混合物中去除，即未磁性標記的細胞為目的細胞。該方法常用于以下情況：
1.去除特定非目的細胞群
2.缺乏目的細胞特異性表面標志物的分選（如某些腫瘤細胞、神經(jīng)元）
3.磁珠分選后需進一步通過陽性選擇分選細胞亞群（CD4+CD25+Treg）
4.分選后的細胞表面不可帶有任何磁珠標記
順序分選
聯(lián)合使用兩種分選策略，例如先陰選后陽選，或先使用可剪切的REAlease磁珠后進行陽性分選。該方法常用于以下情況：
1.同步分離兩種特定細胞亞群：首先通過陰性分選去除共同雜質細胞，隨后利用陽性分選將剩余的目標細胞亞群分開
2.目標抗原在非目的細胞上存在交叉表達，導致直接陽性分選純度不足
3.要分選極稀有的細胞，通過預富集步驟提高目的細胞的純度和得率
全血分選
從血液樣本中直接分選目的細胞，無需裂解紅細胞，無需密度梯度離心。該方法常用于以下情況：
1.簡化實驗流程，省去離心等操作步驟，短時間內獲得高回收率，高活性的目的細胞
2.針對血樣樣本量較少，可最大程度上節(jié)省樣本的損失
❖確認分選柱
對于不同類型的分選柱選擇，關鍵是不要超過推薦的細胞量，否則會使柱子過載，導致分選效果不佳�？筛鶕�(jù)您的細胞總數(shù)和目標細胞數(shù)、分選策略選擇對應的分選柱，可參考下圖。對于具體使用的磁珠，參考每個磁珠說明書附的數(shù)據(jù)表，進行分選柱的選擇。
注：全血分選磁珠需搭配全血分選柱套裝（# 130-093-545），其中包含全血分選柱和全血分選緩沖液。
相關產(chǎn)品貨號：
| 貨號 | 名稱 | 規(guī)格 | 總細胞上限數(shù)目 | 標記細胞上限數(shù)目 |
| 130-042-201 | MS Columns 國內現(xiàn)貨 | 25根/盒 | 2x108 | 107 |
| 130-122-727 | MS Columns plus tubes | 25根+75支 | ||
| 130-042-401 | LS Columns 國內現(xiàn)貨 | 25根/盒 | 2x109 | 108 |
| 130-122-729 | LS Columns plus tubes | 25根+75支 | ||
| 130-042-901 | LD Columns 國內現(xiàn)貸 | 25根 | 5x108 | 108 |
❖確認分選平臺：
根據(jù)您的分選柱，選擇適配的分選平臺。
相關產(chǎn)品貨號：
| 分選柱 | 分選套裝名稱 | 貨號 | 通道 | 分選套裝名稱 |
| MS | MiniMACS Starting kit 國內現(xiàn)貨 | 130-090-312 | 單通道 | 陽性分選 |
| OctoMACS Starting kit | 130-042-108 | 多通道 | ||
| LS/LD | MidiMACS Starting kit 國內現(xiàn)貨 | 130-042-301 | 單通道 | 陽性分選、陰性分選 |
| QuadroMACS Starting kit | 130-091-051 | 多通道 | ||
| MS/LS.LD | Mini&midiMACS Starting kit | 130-042-501 | 單通道*2 | 陽性分選、陰性分選 |
注：全血分選柱可搭配Midi MACS分選器（#130-042-302）或 QuadroMACS Separator分選器 (# 130-090-976)
❖準備分選緩沖液：
方案1：將MACS BSA Stock Solution（#130-091-376）和autoMACS Rinsing Solution（#130-091-222）按照1:20配置，作為分選buffer；分選緩沖液需放置4°預冷。
方案2：如您的細胞對于疊氮化鈉成分不敏感，可直接選擇autoMACS Running Buffer（#130-091-221）進行分選。該buffer內含有少量的疊氮化鈉，對某些敏感細胞，例如神經(jīng)細胞造成影響。
方案3：含0.5%BSA(abs9156-50g)、2mM EDTA(abs9133)的PBS(abs962)，配置后調整PH至7.2，需去除氣泡，氣泡可能導致分選柱堵塞。配好的buffer可先靜置，也可使用真空抽濾、超聲消除氣泡。
❖細胞計數(shù)和活性檢測：
分選前需要檢測單細胞樣本的細胞量及細胞活率，通過細胞量計算您的磁珠添加量；建議起始單細胞活率達到85%以上再進行磁珠分選，會得到較為理想的實驗結果。
您可以選擇對應產(chǎn)品提升樣本的初始活性：
細胞篩網(wǎng)：利用細胞篩網(wǎng)將粗提的單細胞懸液過篩，過濾組織團塊，可根據(jù)您的細胞大小選擇合適孔徑的篩網(wǎng)（MACS® SmartStrainers70μm#130-098-462或70um細胞篩網(wǎng)#abs7232）
碎片去除試劑：利用密度梯度離心的原理去除碎片（Debris Removal Solution#130-109-398或細胞分離液#abs9102）、
死細胞去除磁珠：磁珠標記死細胞表面的磷脂酰絲氨酸，通過高強度磁場，將死細胞去除（ Dead Cell Removal Kit #130-090-101）、
裂紅試劑：利用細胞內外存在鹽離子濃度差而導致細胞膜脹破的原理來裂解無核紅細胞。（Red Blood Cell Lysis Solution (10×)#130-094-183或紅細胞裂解液（1×）#abs9101）
分選過程中
一、 磁珠篇
❖美天旎磁珠為膠體溶液，不會沉淀，實驗前不用搖晃即可直接使用。
❖磁珠說明書中推薦的磁珠標記的體積適用于1×107的細胞。當您的總細胞量少于107細胞，需按照說明使用相同的體積。當超過107細胞數(shù)，將所有試劑體積和總體積按照相應比例增加。
❖磁珠孵育溫度根據(jù)說明書通常為2-8℃，建議在冰箱中避光孵育，直接放置于冰上會使磁珠結合效率變差。提高溫度或延長孵育時間均可能導致非特異性磁性標記。
如磁珠說明書中推薦孵育時間為（+19-25℃），則磁珠應在室溫條件下避光孵育。
二、 分選篇
❖分選柱在加樣前需使用緩沖液潤洗，潤洗分選柱的緩沖液請事先回溫至操作環(huán)境溫度，防止預冷的緩沖液潤洗室溫分選柱，導致分選柱中形成小氣泡，使分選效果不佳。
❖整個分選過程要盡量快速操作，保持細胞處于低溫，分選過程中使用的分選緩沖液需預冷，可防止抗體包裹在細胞表面以及非特異性的磁性標記。
❖每一次向分選柱中加液均需等到分選柱中的液體流空，最后一滴在分選柱中不滴出時，再進行下一步加液。
❖收集分選柱中磁珠標記的細胞液，需要將分選柱從磁場中拿下，放至收集管上，向分選柱加入緩沖液后立即進行栓塞按壓；分選柱栓塞只能按壓一次，請勿反復操作。
❖分選柱為一次性耗材，請勿重復使用。
分選結束后
❖利用流式檢測目的細胞占比及分選后細胞活性，計算出分選純度和分選得率，您可參考以下公式進行計算：
分選純度=分選后目的細胞總數(shù)量/分選后所得所有細胞總數(shù)量
分選得率=分選后目的細胞總數(shù)量/分選前目的細胞總數(shù)量
注意：分選前目的細胞總數(shù)量=標記后未上柱子前的細胞懸液*目的細胞占比
為您詳細解讀3款熱門細胞分選實例，干貨來襲，照搬流程直接做實驗！
巨噬細胞分選：
陽性分選：130-049-601 CD11b MicroBeads, human and mouse（對應凍干磁珠130-049-601可選）130-110-443 Anti-F4/80 MicroBeads UltraPure, mouse
陰性分選：130-100-629 Monocyte Isolation Kit, mouse
陽性分選： CD11b MicroBeads, human and mouse（#130-049-601）
磁性分選耗材
❖MS分選柱（#130-042-201）或LS分選柱（#130-042-401）
❖MS分選柱對應的Mini MACS分選器（#130-042-102）或OctoMACS分選器（#130-042-109）；
❖LS分選柱對應的Midi MACS分選器（#130-042-302）或QuadroMACS分選器（#130-090-976）；
❖MACS MultiStand（#130-042-303）
❖MACS BSA Stock Solution（#130-091-376）和autoMACS Rinsing Solution（#130-091-222）1:20配置
❖Pre-Separation Filters 30μm預分離濾器（#130-041-407）（可選，磁珠標記前去除細胞團，防止堵塞分選柱）
❖如需進行去除分選，需選擇LD分選柱，搭配Midi MACS分選器
實驗步驟
一、 磁珠標記人或小鼠CD11b細胞
1.細胞計數(shù)；
2.細胞懸液300×g離心10分鐘，棄上清；
3.細胞重懸，每1×10⁷細胞添加80μL分選緩沖液（小鼠細胞則添加90μL分選緩沖液）；
4.每1×10⁷細胞添加20 μLCD11b MicroBeads 磁珠（小鼠細胞則添加10 μLCD11b MicroBeads 磁珠）；
5.混勻，于2-8℃孵育15min；
6.（可選）可添加染色抗體，如異硫氰酸熒光素（FITC）標記的抗人/小鼠CD11b 抗體。
7.每1×10⁷個細胞加入1-2 mL分選緩沖液洗滌細胞，300×g離心10分鐘，棄上清
8.添加分選緩沖液，調整溶液體積至500 μL（注：500 μL體積最大重懸至1×108細胞，對于更多的細胞數(shù)量，需要相應提高緩沖液體積。此外，使用 LD 柱操作時，500 μL體積最大重懸至1.25×109細胞）
二、 磁珠分選人或小鼠CD11b細胞
1.將分選柱放入對應的MACS分選器的磁場中，如需詳細分選柱信息請查看MACS分選柱載量數(shù)據(jù)表；
2.用適量緩沖液潤洗分選柱，等到分選柱中液體排空后，再進行下一步驟（MS分選柱使用500 μL分選緩沖液潤洗；LS分選柱使用3 mL分選緩沖液潤洗）；
3.將制備好的細胞懸液加入分選柱中，收集的流穿細胞液為未被標記的細胞；
4.分別用分選緩沖液清洗柱子三次（MS分選柱使用500 μL分選緩沖液清洗3次；LS分選柱使用3 mL分選緩沖液清洗3次），收集未被標記的非CD11b細胞；
5.從分選器中取出分選柱，將其放到合適的收集管上；
6.吸取適量的緩沖液（MS：1 mL；LS：5 mL），加到分選柱中，立即將栓塞推入分選柱中，沖洗出磁珠標記的細胞，即為CD11b細胞；
（可選）若需提高 CD11b⁺細胞純度，可將洗脫組分用新的 MS 或 LS 柱子重復以上步驟再次分選。
用LD（130-042-901）分選柱去除分選
1.將LD分選柱放入相應的MACS分選器的磁場中；
2.用2mL緩沖液濕潤分選柱；
3.將制備好的細胞懸液加到分選柱中；
4.收集流出來的細胞，用1mL緩沖液清洗分選柱兩次，收集流出來的液體即為未被磁珠標記的CD11b細胞。
陽性分選：Anti-F4/80 MicroBeads UltraPure, mouse（#130-110-443）
磁性分選耗材
❖MS分選柱（#130-042-201）或LS分選柱（#130-042-401）
❖MS分選柱對應的Mini MACS分選器（#130-042-102）或OctoMACS分選器（#130-042-109）；
❖LS分選柱對應的Midi MACS分選器（#130-042-302）或QuadroMACS分選器（#130-090-976）；
❖MACS MultiStand（#130-042-303）
❖MACS BSA Stock Solution（#130-091-376）和autoMACS Rinsing Solution（#130-091-222）1:20配置
❖Pre-Separation Filters 30μm預分離濾器（#130-041-407）（可選，磁珠標記前去除細胞團，防止堵塞分選柱）
實驗步驟
一、 磁珠標記Anti-F4/80細胞
1.細胞計數(shù)；
2.細胞懸液300×g離心10分鐘，棄上清；
3.細胞重懸，每1×107細胞添加90μL分選緩沖液；
4.每1×107細胞添加10 μLAnti-F4/80 MicroBeads UltraPure磁珠；
5.混勻，于2-8℃孵育15min；
6.每1×10⁷個細胞加入1-2 mL分選緩沖液洗滌細胞，300×g離心10分鐘，棄上清
7.添加分選緩沖液，調整溶液體積至500 μL（注：500 μL體積最大重懸至1×108細胞，對于更多的細胞數(shù)量，需要相應提高緩沖液體積）
二、 磁珠分選Anti-F4/80細胞
1.將分選柱放入對應的MACS分選器的磁場中，如需詳細分選柱信息請查看MACS分選柱載量數(shù)據(jù)表；
2.用適量緩沖液潤洗分選柱，等到分選柱中液體排空后，再進行下一步驟（MS分選柱使用500 μL分選緩沖液潤洗；LS分選柱使用3 mL分選緩沖液潤洗）；
3.將制備好的細胞懸液加入分選柱中，收集的流穿細胞液為未被標記的細胞；
4.分別用分選緩沖液清洗柱子三次（MS分選柱使用500 μL分選緩沖液清洗3次；LS分選柱使用3 mL分選緩沖液清洗3次），收集未被標記的非Anti-F4/80細胞；
5.從分選器中取出分選柱，將其放到合適的收集管上；
6.吸取適量的緩沖液（MS：1 mL；LS：5 mL），加到分選柱中，立即將栓塞推入分選柱中，沖洗出磁珠標記的細胞，即為Anti-F4/80細胞；
7.（可選）若需提高F4/80+細胞純度，可將洗脫組分用新的 MS 或 LS 柱子重復以上步驟再次分選。
Monocyte細胞分選：Monocyte Isolation Kit, mouse（#130-100-629）
磁性分選耗材
❖LS分選柱（#130-042-401）
❖LS分選柱對應的Midi MACS分選器（#130-042-302）或QuadroMACS分選器（#130-090-976）；
❖MACS MultiStand（#130-042-303）
❖MACS BSA Stock Solution（#130-091-376）和autoMACS Rinsing Solution（#130-091-222）1:20配置
❖Pre-Separation Filters 30μm預分離濾器（#130-041-407）（可選，磁珠標記前去除細胞團，防止堵塞分選柱）
實驗步驟
一、 磁珠標記非單核細胞
1.細胞計數(shù)；
2.細胞懸液300×g離心10分鐘，棄上清；
3.細胞重懸，每5×107細胞添加175μL分選緩沖液；
4.每5×107細胞添加25 µL FcR Blocking試劑，混勻；
5.每5×107細胞添加50 μL Monocyte Biotin-Antibody Cocktail抗體；
6.混勻，于2-8℃孵育5min；
7.每5×107細胞添加10 mL分選緩沖液洗滌，300g 離心 10分鐘，棄上清；
8.細胞重懸，每5×107細胞添加400μL分選緩沖液；
9.每5×107細胞添加100 μL Anti-Biotin MicroBeads磁珠；
10.混勻，于2-8℃孵育10min；
二、 磁珠去除非單核細胞
1.將LS分選柱放入合適的分選器磁場中，如需詳細信息請查看MACS分選柱說明書；
2.用3 ml分選緩沖液潤洗分選柱，等到分選柱中液體排空后，再進行下一步驟；
3.將制備好的細胞懸液加入到分選柱中，收集流出液，其中包含未標記的細胞，即富集的 單核細胞；
4.用3 ml緩沖液沖洗柱子三次，收集流過的未標記細胞，并與第3步中的流出液合并。
5.(可選）如需非單核細胞，可將分離器上的分選柱移除，并將其放置在合適的收集管中。向分選柱中加入5 ml分選緩沖液。立即通過將栓塞推入分選柱中，沖洗出磁性標記的非單核細胞保存?zhèn)溆谩?/span>
以上就是三款熱門巨噬細胞磁珠分選的實驗流程！想了解更多巨噬細胞磁珠產(chǎn)品，小優(yōu)為您總結了單核巨噬細胞分選磁珠產(chǎn)品合集：
Human 單核巨噬細胞分選：
貨號130-090-879 StraightFrom® Whole Blood CD14 MicroBeads, human
貨號130-114-976 StraightFrom® Buffy Coat CD14 MicroBead Kit, human
貨號130-117-026 StraightFrom® LRSC CD14 MicroBead Kit, human
貨號130-096-537 Pan Monocyte lsolation Kit, human
貨號130-050-201 CD14 MicroBeads, human
貨號130-118-906 CD11b MicroBeads, human and mouse
貨號130-117-337 Classical Monocyte lsolation Kit, human
貨號130-091-765 CD16+ Monocyte lsolation Kit, human
貨號130-093-026 Slan (M-DC8)+ Monocyte lsolation Kit, human
貨號130-124-420 CD163 MicroBead Kit, human
Mouse 單核巨噬細胞分選：
貨號130-049-601 CD11b MicroBeads, human and mouse
貨號130-110-443 Anti-F4/80 MicroBeads UltraPure, mouse
貨號130-096-354 CD115 MicroBead Kit, mouse
貨號130-100-629 Monocyte lsolation Kit (BM), mouse
貨號130-118-513 Anti-Siglec-F MicroBeads, mouse
貨號130-110-434 Macrophage lsolation Kit (Peritoneum), mouse
