改造慢病毒高效靶向T細(xì)胞，體內(nèi)生成CAR-T細(xì)胞

近年來，病毒和非病毒載體被開發(fā)用于體內(nèi)T細(xì)胞工程，其中慢病毒（LV）載體因能夠通過基因組整合實現(xiàn)CAR轉(zhuǎn)基因在T細(xì)胞中的長期表達(dá)而備受關(guān)注。然而，用于體外T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的泛嗜性水皰性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）偽型LV載體在體內(nèi)工程中適用性較差，理想情況下載體應(yīng)特異性靶向目標(biāo)細(xì)胞類型。

 

近期，來自牛津生物醫(yī)學(xué)（UK）有限公司的研究團(tuán)隊在《分子治療》雜志上發(fā)表了一項突破性研究，該研究描述了一種改進(jìn)的重定向Nipah包膜系統(tǒng)與第四代慢病毒載體相結(jié)合的方法，能夠在體內(nèi)特異性靶向T細(xì)胞并高效生成功能性CAR-T細(xì)胞。
一
研究方法概述
該研究采用了一種創(chuàng)新的四代慢病毒載體平臺（稱為TetraVecta系統(tǒng)），結(jié)合重定向的Nipah病毒（NiV）包膜蛋白。研究人員對Nipah包膜蛋白進(jìn)行了改造，其中G蛋白通過四個點突變（E501A、W504A、Q530A和E533A）防止與天然受體EphrinB2/B3結(jié)合，并將靶向分子（如DARPin或VHH）融合到羧基末端以實現(xiàn)特異性靶向。同時，G和F蛋白的胞質(zhì)尾被截短以促進(jìn)載體顆粒的偽型化。

縮略圖
此外，研究還采用了 TRiP 系統(tǒng)來抑制CAR轉(zhuǎn)基因在載體生產(chǎn)過程中的翻譯，減少CAR蛋白摻入載體顆粒的風(fēng)險。體內(nèi)實驗使用人源化NCG小鼠模型（植入人CD34+臍帶血干細(xì)胞），通過靜脈注射載體評估體內(nèi)CAR T細(xì)胞的生成效率和特異性。
二
主要研究結(jié)果
01

改造LV載體增強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

 

研究人員首先探索了如何提高重定向LV載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。他們發(fā)現(xiàn)，與單鏈可變片段（scFv）相比，使用設(shè)計的錨蛋白重復(fù)蛋白（DARPin）作為靶向分子能夠顯著提高載體對CD8+ T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
圖1. 使用DARPIN和混合包膜組合提升了用改良NiV包膜偽型的重定向LV載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率
如圖1所示，研究團(tuán)隊對Nipah包膜蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。他們假設(shè)，在重定向的Nipah包膜中，靶向分子在附著蛋白C末端的 presence 可能會阻礙G蛋白與F蛋白的相互作用，而這種相互作用是觸發(fā)膜融合所必需的。為此，他們開發(fā)了一種"混合"包膜組成，將重定向的CD8-NiV Gm△34與非靶向的NiV Gm△34按一定比例混合，同時保留F△22融合蛋白。
實驗結(jié)果表明，與100%重定向G蛋白的載體相比，采用混合包膜（75%重定向CD8-NiV Gm△34和25%非靶向NiV Gm△34）的LV載體顯著提高了對CD8+ T細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移效率。通過評估不同比例的重定向與非靶向G蛋白，研究人員確定了50%-75%重定向CD8DARPin-NiV Gm△34和25%-50%非靶向NiV Gm△34的最佳范圍。重要的是，在所有條件下，載體對不表達(dá)CD8的細(xì)胞群的轉(zhuǎn)導(dǎo)均保持在最低水平，表明特異性得以保持。
02

不同靶向分子特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)驗證

研究人員進(jìn)一步評估了不同類型的靶向分子在Nipah重定向系統(tǒng)中的功能。除了DARPin外，他們還測試了單域VHH抗體結(jié)合劑對CD8的靶向效果。

圖2. 混合NiV包膜的重新定向LV載體，利用scFv、DARpin或VHH靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)CD4、CD8和CD3 T細(xì)胞
如圖2所示，兩種CD8的VHH結(jié)合劑（駱駝源VHH和人源化版本）均能夠產(chǎn)生CD8特異性LV載體，其效率優(yōu)于scFv，與使用CD8 DARPin的載體相當(dāng)。這表明VHH結(jié)合劑可能因其較小的尺寸和較低的聚集傾向而在此設(shè)置中同樣有益。
為了靶向所有T細(xì)胞亞群或特異性靶向CD4+ T細(xì)胞，研究人員還評估了針對CD3和CD4的DARPin結(jié)合劑。結(jié)果表明，CD3和CD4 DARPins均能有效介導(dǎo)CAR基因向各自T細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)移。此外，CD3 DARPin的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高于CD3 scFv，支持了DARPins在此背景下的實用性。所有重定向載體均顯示了對目標(biāo)細(xì)胞類型的特異性，與VSV-G偽型對照載體形成鮮明對比。
研究人員還評估了不同比例的CD3DARPin-NiV Gm△34和非靶向NiV Gm△34對轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響。與100% CD3DARPin-NiV Gm△34的載體相比，混合包膜組成提高了載體對表達(dá)目標(biāo)（CD3+）T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率�；�于這些結(jié)果，研究團(tuán)隊選擇使用75%重定向NiV Gm△34和25%非靶向NiV Gm△34的混合包膜進(jìn)行后續(xù)實驗。
03

改進(jìn)安全性和最小CAR摻入的第四代重定向LV載體

為了提高載體的安全性，研究人員評估了能否使用在載體生產(chǎn)過程中抑制CAR轉(zhuǎn)基因翻譯的系統(tǒng)來限制CAR蛋白摻入載體顆粒。

圖3. 利用SupA2KO-LV基因組和TRiP系統(tǒng)制備重定向慢病毒載體，減少了vRNA剪接并防止了CAR被載體顆粒中摻入
如圖3所示，研究采用了TRiP系統(tǒng)的更新版本，該版本在LV載體生產(chǎn)過程中介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因翻譯的抑制。該系統(tǒng)在第四代TetraVecta系統(tǒng)的SupA2KO-LV骨架中表現(xiàn)最佳，該骨架還具有多項改進(jìn)，可提高載體產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性。
研究表明，使用含有TRAP結(jié)合序列（tbs）的SupA2KO-LV載體基因組時，載體顆粒中幾乎檢測不到CAR蛋白，而在第三代LV基因組中，即使存在TRAP蛋白，CAR蛋白仍然可檢測到。這種差異歸因于第三代基因組中主要剪接供體（MSD）的強(qiáng)效剪接產(chǎn)生大量表達(dá)CAR的剪接vRNA。
而SupA2KO-LV中的2KO修飾滅活了MSD的剪接，因此在這些額外的CAR編碼RNA缺失的情況下，LV載體產(chǎn)品中檢測不到CAR蛋白�？傊�，最優(yōu)化的CAR蛋白從載體顆粒中的去除需要2KO修飾和TRiP系統(tǒng)結(jié)合使用。
04

體內(nèi)高效產(chǎn)生并擴(kuò)增CAR-T細(xì)胞


在體外成功鑒定了這些重定向載體在效率和質(zhì)量方面的改進(jìn)后，研究人員評估了它們在體內(nèi)直接生成功能性CAR+ T細(xì)胞的能力。
圖4.  通過靜脈注射第四代SupA2KO-LV載體，靶向CD3或CD8 T細(xì)胞，快速高效地在體內(nèi)生成CAR T細(xì)胞
如圖4所示，研究團(tuán)隊選擇了性能最佳的結(jié)合劑進(jìn)行體內(nèi)評估，針對CD8的DARPin和人源化VHH，以及針對CD3的DARPin，并使用了上述混合Nipah包膜組成。載體通過靜脈注射注入人源化NCG小鼠模型。
每周通過流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測血液中的CAR表達(dá)發(fā)現(xiàn)，注射重定向載體或高劑量VSV-LV后14-21天內(nèi)，所有組別均檢測到高水平的CAR+ CD3+和CD8+ T細(xì)胞，且顯著高于背景水平。CD3DARPin-LV產(chǎn)生的CAR+ T細(xì)胞水平最高（約54%的CD3+細(xì)胞）。兩種不同的CD8靶向載體（CD8DARPin-LV和CD8VHH-LV載體）產(chǎn)生的CAR+ T細(xì)胞水平相對相似，但略低于CD3DARPin-LV載體。只有CD3DARPin-LV載體產(chǎn)生了相當(dāng)數(shù)量的CD4+和CD8+ CAR+細(xì)胞。
盡管VSV-G載體的功能滴度較高，但VSV-LV組產(chǎn)生的CAR+ T細(xì)胞數(shù)量低于CD3和CD8靶向載體，且呈劑量依賴性。CAR T細(xì)胞的頻率在D7時非常低，但到D14-D21時，非常高比例的T細(xì)胞呈CAR+，表明轉(zhuǎn)導(dǎo)后CAR T細(xì)胞在體內(nèi)擴(kuò)增了2-3周，然后收縮。在D28終止時，BM和脾臟中也檢測到高頻的CAR T細(xì)胞，所有載體處理組中BM的CAR+ T細(xì)胞比例顯著高于脾臟和血液，可能是由于持續(xù)的淋巴細(xì)胞生成所致。
05

高效清除B細(xì)胞


有效殺傷B細(xì)胞并誘導(dǎo)B細(xì)胞再生障礙研究人員評估了B細(xì)胞的清除情況，作為CAR T細(xì)胞活性的衡量指標(biāo)。如圖5所示，所有載體處理組中B細(xì)胞的比例在注射后14-21天內(nèi)顯著下降，到D28時，所有重定向載體處理組和高劑量VSV-LV組均出現(xiàn)嚴(yán)重的B細(xì)胞再生障礙。B細(xì)胞再生障礙的動力學(xué)在不同載體間略有差異，VSV-LV組比其他組更早出現(xiàn)B細(xì)胞減少，在D7時即顯著下降，而此時CAR T細(xì)胞尚不易檢測到。

圖5. 利用第四代重定向SupA2KO-LV載體在體內(nèi)生成的CAR T細(xì)胞，誘導(dǎo)快速且持續(xù)的B細(xì)胞發(fā)育不良
在重定向載體處理組中，CD3DARPin-LV載體對B細(xì)胞水平的影響略早于CD8靶向LV載體組。對于VSV-LV組，低劑量和中劑量組的B細(xì)胞清除動力學(xué)較慢，但后期無統(tǒng)計學(xué)差異。
在D28終止時，BM和脾臟中也觀察到顯著的B細(xì)胞再生障礙。盡管BM中的B細(xì)胞顯著減少，但該組織中殘留的B細(xì)胞數(shù)量略高于血液和脾臟，推測是由于BM巢中植入的造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞持續(xù)產(chǎn)生淋巴細(xì)胞所致。
06

CD8和CD3靶向包膜與VSV-G的T細(xì)胞靶向性對比


研究人員通過流式細(xì)胞術(shù)分析血液、BM和脾臟免疫細(xì)胞群中的CAR表達(dá)來評估靶向載體的特異性。
如圖6所示，所有重定向載體介導(dǎo)的CAR表達(dá)主要限于CD3+ T細(xì)胞，在其他人類免疫細(xì)胞群（NK細(xì)胞、單核細(xì)胞或B細(xì)胞）中檢測到的表達(dá)極少。CD8靶向載體的CAR表達(dá)主要限于CD8+ T細(xì)胞，盡管在少數(shù)動物的CD4+ T細(xì)胞中檢測到低頻率的CAR+細(xì)胞，可能是由于轉(zhuǎn)導(dǎo)了雙陽性CD8+CD4+前體細(xì)胞。

圖6. 體內(nèi)利用第四代重定向SupA2KO-LV載體對T細(xì)胞的特異性靶向
非靶向VSV-G偽型載體的CAR表達(dá)也主要局限于T細(xì)胞，在其他人類免疫細(xì)胞類型中檢測到的表達(dá)極少；然而，在高劑量VSV-LV處理的動物中，在脾臟的小鼠CD45+區(qū)室中額外觀察到了高頻率的CAR+細(xì)胞，但在BM或血液中未觀察到。這些細(xì)胞可能是髓系細(xì)胞，因為所使用的NCG小鼠模型不產(chǎn)生小鼠淋巴樣細(xì)胞。
研究人員還通過分析處理動物肝臟中的整合載體拷貝數(shù)（VCN）進(jìn)一步評估了重定向載體的特異性。正如預(yù)期，在用VSV-G偽型載體處理的小鼠肝臟中檢測到高水平載體，且觀察到劑量反應(yīng)。相反，重定向載體顯示肝臟轉(zhuǎn)導(dǎo)的證據(jù)極少，檢測到的載體拷貝數(shù)非常低。

寫在最后


總之，本研究成功改進(jìn)并將LV重定向包膜與第四代LV平臺相結(jié)合，用于在動物研究中特異性高效地向T細(xì)胞遞送CAR轉(zhuǎn)基因。這些改進(jìn)將推動體內(nèi)CAR T療法的實施和可行性，通過消除體外制造CAR T細(xì)胞的需求，提高患者對這些治愈性療法的可及性。未來研究需要評估低劑量重定向載體對CAR T細(xì)胞生成和腫瘤細(xì)胞清除的影響，以優(yōu)化治療劑量并最小化潛在不良反應(yīng)。

 

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