文獻(xiàn)解讀：治療性黑磷納米片通過誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞應(yīng)答增強(qiáng)腫瘤抑制效果

期刊：Advanced science
影響因子：14.1
通訊單位：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
通訊作者：胡源，馬小鵬，楊振業(yè)，余發(fā)智
伯豪技術(shù)服務(wù)+產(chǎn)品：單細(xì)胞RNA測序、伯優(yōu)^®組織樣本懸液制備試劑盒

導(dǎo)語
癌癥治療中，黑磷（BP）展現(xiàn)出作為藥物載體和光熱劑的潛力，但在癌癥治療中的功能仍有待深入探索。本研究探討了聚乙二醇功能化黑磷（BP-PEG）納米片在乳腺癌模型中的免疫調(diào)節(jié)作用。作者使用包括 4T1 荷瘤BALB/c 小鼠和 MMTV-PyMT 轉(zhuǎn)基因小鼠在內(nèi)的免疫活性小鼠模型。研究發(fā)現(xiàn) BP-PEG 能顯著抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，且不直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞毒性。質(zhì)譜流式分析表明，BP-PEG 通過募集中性粒細(xì)胞重塑腫瘤免疫微環(huán)境。中性粒細(xì)胞耗竭實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，BP-PEG 的抗腫瘤效應(yīng)依賴于中性粒細(xì)胞。常規(guī)RNA測序和單細(xì)胞 RNA 測序結(jié)果顯示，BP-PEG 主要被巨噬細(xì)胞攝取，進(jìn)而誘導(dǎo) IL1A 和 CXCL2 等炎癥因子釋放，這些因子會(huì)增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的募集和激活，從而放大抗腫瘤免疫應(yīng)答。最后，共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BP-PEG 確實(shí)能增強(qiáng)中性粒細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞的抗腫瘤活性。這些發(fā)現(xiàn)表明，BP-PEG 是一種能夠重編程腫瘤微環(huán)境、以增強(qiáng)抗乳腺癌先天免疫的免疫調(diào)節(jié)制劑。通過激活中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤活性，BP-PEG 提供了一種獨(dú)特的治療策略，有望提升現(xiàn)有癌癥免疫治療的療效。

主要技術(shù)
單細(xì)胞RNA測序、伯優(yōu)^®組織樣本懸液制備試劑盒
（技術(shù)服務(wù)+產(chǎn)品由伯豪生物提供）

 研究結(jié)果
1. BP-PEG 合成表征及抗腫瘤抗轉(zhuǎn)移活性驗(yàn)證
為提升黑磷（BP）的穩(wěn)定性，本研究通過超聲剝離BP晶體并與聚乙二醇（PEG）偶聯(lián)，成功合成了聚乙二醇修飾的黑磷（BP-PEG）納米片。透射電鏡和掃描電鏡（SEM）結(jié)果顯示，BP和BP-PEG均呈現(xiàn)典型的二維片狀結(jié)構(gòu)，BP-PEG納米片尺寸多集中在100 nm左右，小于200 nm，有利于體內(nèi)穩(wěn)定性和組織靶向性；zeta電位從BP的-27.6 mV變?yōu)锽P-PEG的-18.1 mV，證實(shí)PEG修飾成功，顯著提升了材料的膠體穩(wěn)定性；能量色散X射線光譜（EDS）、紅外光譜（FTIR）、X射線衍射（XRD）和拉曼光譜等進(jìn)一步驗(yàn)證了BP-PEG的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)特征，原子力顯微鏡（AFM）顯示其厚度為10-20 nm，較未修飾BP納米片略有增加。在免疫活性乳腺癌小鼠模型的抗腫瘤活性評(píng)估中，將4T1乳腺癌細(xì)胞接種到BALB/c小鼠乳腺脂肪墊構(gòu)建同源腫瘤模型，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約100 mm³時(shí)靜脈注射BP-PEG。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，BP-PEG處理組的腫瘤生長顯著受到抑制，腫瘤明顯降低，主要器官組織學(xué)分析未發(fā)現(xiàn)明顯毒性。對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明，單獨(dú)使用PEG對(duì)腫瘤生長無顯著影響，相同濃度下BP單獨(dú)處理與BP-PEG的抗腫瘤效果相當(dāng)，而5 mg/kg劑量的BP-PEG效果弱于10 mg/kg，因此確定10 mg/kg為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的適宜劑量。在更貼近人類乳腺癌進(jìn)展的MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，BP-PEG同樣表現(xiàn)出顯著的腫瘤生長抑制作用，證實(shí)其在模擬人類乳腺癌的模型中具有穩(wěn)定的抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移作用。

圖1 BP-PEG納米片的表征及其在小鼠乳腺癌模型中的抗腫瘤活性 

2. BP-PEG 無直接細(xì)胞毒性且依賴免疫系統(tǒng)起效
為探究BP-PEG的抗腫瘤機(jī)制，作者首先通過熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)比了腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)外對(duì)BP-PEG的攝取情況，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞攝取的BP-PEG量相當(dāng)于體外4T1細(xì)胞在5 μg/mL濃度下的攝取水平。但細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)表明，該濃度及更高濃度（最高達(dá)100 μg/mL）的BP-PEG在72小時(shí)內(nèi)均未對(duì)4T1細(xì)胞增殖和存活產(chǎn)生顯著影響，說明BP-PEG在生理相關(guān)濃度下無直接腫瘤細(xì)胞毒性。為驗(yàn)證免疫系統(tǒng)在BP-PEG抗腫瘤過程中的作用，本研究使用免疫缺陷NOD scid gamma（NSG）小鼠構(gòu)建4T1腫瘤模型，結(jié)果顯示BP-PEG在該模型中無法抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，表明其抗腫瘤活性依賴完整的免疫系統(tǒng)。將人類MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞與乳腺癌患者PBMC共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用BP-PEG或PBMC僅能導(dǎo)致少量腫瘤細(xì)胞死亡，而兩者聯(lián)合使用時(shí)，超過90%的腫瘤細(xì)胞被清除，且PBMC的細(xì)胞組成與腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞分布相似，這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)BP-PEG通過調(diào)控免疫微環(huán)境發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖2 BP-PEG依賴完整的免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤特性

3. RNA 測序揭示免疫相關(guān)通路特異性激活
BALB/c小鼠和NSG小鼠腫瘤組織做bulk RNA測序，結(jié)果顯示，BP-PEG處理后，兩種小鼠模型的腫瘤基因表達(dá)譜均發(fā)生改變，但NSG小鼠與BALB/c小鼠的DEGs僅重疊17個(gè)，而BALB/c小鼠中存在234個(gè)特異性差異表達(dá)基因。通路富集分析表明，這些特異性DEGs顯著富集于免疫相關(guān)通路，其中細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路上調(diào)最為明顯，與BP-PEG依賴免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用的結(jié)論一致。qPCR驗(yàn)證顯示，BP-PEG處理后，IL1A、CXCL2、CCR2等參與腫瘤免疫微環(huán)境重塑的基因表達(dá)顯著上調(diào)，這些基因可能通過調(diào)控細(xì)胞因子分泌和免疫細(xì)胞招募，推動(dòng)腫瘤免疫微環(huán)境從免疫抑制向免疫激活轉(zhuǎn)變。
 

圖3 BP-PEG在免疫活性小鼠中特異性激活免疫調(diào)控通路

4. 中性粒細(xì)胞募集增加并激活效應(yīng)免疫細(xì)胞
為深入解析BP-PEG對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境中免疫細(xì)胞群體的影響，作者使用CyTOF對(duì)BALB/c小鼠腫瘤組織中的免疫細(xì)胞做了全面分析。t-SNE聚類識(shí)別出26個(gè)不同的細(xì)胞亞群，包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、CD8⁺T細(xì)胞、CD4⁺T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）和NK細(xì)胞等。BP-PEG處理組中性粒細(xì)胞亞群（C18）的數(shù)量和比例顯著增加，占CD45⁺免疫細(xì)胞的比例超過20%，成為優(yōu)勢(shì)細(xì)胞群體；同時(shí)，免疫抑制性細(xì)胞（Tregs和M2型巨噬細(xì)胞）的比例降低，而CD8⁺T細(xì)胞和NK細(xì)胞中細(xì)胞毒性標(biāo)志物GZMB的表達(dá)強(qiáng)度顯著上調(diào)，表明其抗腫瘤活性增強(qiáng)。免疫組化染色進(jìn)一步證實(shí)，BP-PEG處理后腫瘤組織中Ly6G⁺中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著增加，且GZMB⁺陽性細(xì)胞比例上升，驗(yàn)證了CyTOF的分析結(jié)果，說明BP-PEG通過募集中性粒細(xì)胞并激活效應(yīng)免疫細(xì)胞的抗腫瘤功能發(fā)揮作用。

圖4 BP-PEG增強(qiáng)中性粒細(xì)胞募集并激活抗腫瘤免疫細(xì)胞

5.中性粒細(xì)胞核心作用及腫瘤殺傷能力協(xié)同增強(qiáng)機(jī)制
中性粒細(xì)胞耗竭實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了其在BP-PEG抗腫瘤中的核心作用。在4T1荷瘤 BALB/c小鼠中，從腫瘤接種后第3天開始每日腹腔注射抗Ly6G抗體以耗竭中性粒細(xì)胞，結(jié)果顯示，單獨(dú)使用抗Ly6G抗體對(duì)腫瘤生長無明顯影響，但BP-PEG與抗Ly6G抗體聯(lián)合使用時(shí)，BP-PEG的腫瘤生長抑制作用被顯著逆轉(zhuǎn)，腫瘤重量明顯增加。免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證顯示，抗Ly6G抗體處理后腫瘤組織中Ly6G⁺中性粒細(xì)胞幾乎完全消失，同時(shí)GZMB⁺陽性細(xì)胞比例顯著降低，表明中性粒細(xì)胞耗竭導(dǎo)致抗腫瘤免疫應(yīng)答減弱。單細(xì)胞RNA測序和細(xì)胞間相互作用分析發(fā)現(xiàn)，BP-PEG主要被巨噬細(xì)胞吞噬，巨噬細(xì)胞攝取BP-PEG后激活炎癥信號(hào)通路，促使中性粒細(xì)胞遷移、脫顆粒調(diào)控、先天免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，分泌CXCL2等趨化因子；通過CXCL-CCR信號(hào)通路（尤其是CXCL2-CXCR2通路）招募中性粒細(xì)胞到腫瘤部位。使用CXCR2抑制劑SB225002處理后，BP-PEG的抗腫瘤效果幾乎完全被阻斷，證實(shí)CXCL2-CXCR2信號(hào)通路是BP-PEG介導(dǎo)中性粒細(xì)胞募集的關(guān)鍵途徑。此外，細(xì)胞間相互作用分析顯示，BP-PEG處理后中性粒細(xì)胞與NK細(xì)胞的相互作用數(shù)量和強(qiáng)度顯著高于與CD8⁺T細(xì)胞的相互作用，免疫熒光顯示兩者在腫瘤組織中空間定位密切；通路富集分析表明，BP-PEG上調(diào)了中性粒細(xì)胞中先天免疫應(yīng)答、脫顆粒、氧化應(yīng)激等抗腫瘤相關(guān)通路，增加了具有抗腫瘤表型的T1和T2型中性粒細(xì)胞比例，同時(shí)增強(qiáng)了NK細(xì)胞中顆粒酶介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡通路。共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，從BP-PEG處理組腫瘤中分離的中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞，對(duì)GFP標(biāo)記的4T1細(xì)胞的殺傷能力顯著高于生理鹽水組，而NK細(xì)胞耗竭會(huì)部分逆轉(zhuǎn)BP-PEG的抗腫瘤效果，表明BP-PEG通過增強(qiáng)中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞的殺瘤能力，協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖5 中性粒細(xì)胞對(duì)BP-PEG的抗腫瘤作用至

參考文獻(xiàn)：
1. Wang J, Yu W, Shen H, et al (2025) Therapeutic Black Phosphorus Nanosheets Elicit Neutrophil Response for Enhanced Tumor Suppression. Adv Sci (Weinh) 12:e2414779. https://doi.org/10.1002/advs.202414779

本產(chǎn)品適用于多種組織樣本的單細(xì)胞懸液制備。組織樣本預(yù)處理后利用酶溫和、快速、有效地破壞細(xì)胞外基質(zhì)，釋放細(xì)胞，經(jīng)過篩、離心等標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，生成高質(zhì)量的單細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)操作簡單便捷，不需要特別的解離儀器，可輕松實(shí)現(xiàn)多種組織的解離。制備的單細(xì)胞懸液可用于單細(xì)胞測序、細(xì)胞培養(yǎng)或其他細(xì)胞相關(guān)檢測。

本產(chǎn)品適用于胃、腎、肺、心臟、肝、腸、甲狀腺、胸腺、食管、鼻組織、皮膚、黏膜、胚胎、淋巴、睪丸、乳腺、卵巢、腫瘤組織等樣本（軟骨、硬骨、脂肪、胰腺、腦組織除外）。